2.2.5. Виділення плазміди

ДНК виділяли з 4 мл культури за допомогою набору реактивів «QIAprep Spin Miniprep Kit». Принцип методу базується на адсорбції плазмідної ДНК на силікатній мембрані колонки у високо сольовому розчині.

Бактеріальні клітини осаджували центрифугуванням при 10 000 g протягом 2 хв. Осад бактеріальних клітин ресуспендували в 250 мкл буферу Р1 (50 мМ Тріс-HCl, рН 8.0, 10 мМ ЕДТА, 100 мкг/мкл RNaseА). До суспензії додавали 250 мкл розчину Р2 (0,2 М NaOH, 1% SDS) та ретельно перемішували. Додавання розчину Р2 спричиняє лізис бактеріальних клітин та денатурацію ДНК в дужному середовищі. Потім до суміші додавали 350 мкл буферу N3 і ретельно перемішували. Оскільки розчин N3 має кислий рН, його додавання нейтралізує луг, що викликає ренатурацію геномної та плазмідної ДНК. Після цього суміш центрифугували 10 хв при 12400 g для осадження геномної ДНК, білків та клітинного дебрісу. Супернатант, що містив плазмідну ДНК, переносили на колонку QIAprep і центрифугували 60 сек при 12400 g. Рідину з дна пробірки видаляли і промивали колонку 0,5 мл буферу РВ. Далі колонку центрифугували 60 сек при 12400 g та після цього видаляли рідину з пробірки. Колонку промивали 0,75 мл буферу РЕ (Трис-HCl, етанол, pH 8.0) і центрифугували 60 сек при 12400 g. Рідину з пробірки, в яку вміщено колонку, видаляли і додатково центрифугували колонку для повного видалення залишків буферу. Перед тим, як змити з колонки плазмідну ДНК, колонку поміщали у чисту 1,5 мл пробірку, далі додавали 50 мкл буферу EB (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0), витримували колонку 1 хв при кімнатній температурі, а потім центрифугували 1 хв при 12400 g.

Підтвердження наявності необхідного продукту здійснювали за допомогою рестрикційного аналізу рестриктазами Hinc II і Nco I по сайтам, які дозволяють побачити дві смуги для остаточного підтвердження правильності отриманого фрагмента. Сайти рестрикції за цими рестриктазами є унікальними тобто зустрічаються по одному разу.

Щоб перевірити наявність нашої вставки (гена люциферази) і ефективності праймерів, на наступному етапі було вирішено провести ПЛР – скринінг бактеріальних колоній.

2.2.6. ПЛР-скринінг

ПЛР-скринінг колоній дозволяє визначити наявність вставки з використанням праймерів до нашої вставки. Доволі швидкий і точний метод визначення, що допомагає знайти колонії, які потрібно використовувати надалі в роботі. Відбирали 10 колоній, позначаючи їх на чашці Петрі для подальшої ідентифікації. Крім цього негативний і позитивний контроль слугували для визначення достовірності реакції. В негативний контроль ми не додавали матрицю, а в позитивний контроль ми додали плазміду pGEM-3Z, в яку ми і заклонували нашу вставку. Об`єм реакції складав 15 μl. В епендорфи вносили: 10х буфер, MgCI 2 (25 mM). Реакція ПЛР складалась з початкової денатурації 4 хв, 94^оС та сорока циклів ампліфікації в режимі: денатурація – 94 С, 15 сек, відпалювання – 55С, 15 сек, синтез – 72 С, 15 сек. Реакція закінчувалась фінальною полімеризацією при 72 С, 4 хв.

2.2.7. Виділення плазміди midi-препаративним методом.

Культуру клітин, в яких було підтверджено наявність необхідної рекомбінантної плазмідної ДНК після ПЛР-скринінга, нарощували у 65 мл культури для виділення більшої кількості плазмідної ДНК. Культуру вирощували у середовищі LB з ампіцилін протягом 16 год при 37 °С при постійному перемішуванні (250 об./хв). Після завершення інкубації, переносили в центрифужні епендорфи і центрифугували при 7000 g 3 хв. при +4˚С. Промивали осад 25 мл STE і центрифугували при 7000 g 3 хв. при +4˚С. Осад суспендували в 3 мл L1 (50 мМ Тріс-HCl, рН 8.0, 10 мМ ЕДТА). До отриманої суспензії додавали 6,5 мл розчину L2 (0,2 М NaOH, 1% SDS) і обережно перемішували, перевертаючи пробірку декілька разів так, щоб запобігти фрагментації хромосомної ДНК. При цьому відбувався лізис клітин і лужна денатурація ДНК. Щоб запобігти незворотній денатурація плазмідної ДНК, денатурацію проводили не довше 5 хв. Далі додавали 5 мл охолодженого розчину L3 (3 M СН₃СООK, pH 4,8) і обережно та ретельно перемішували, перевертаючи пробірку декілька разів. При цьому відбувалась ренатурація плазмідної ДНК та масивна преципітація хромосомної ДНК і білків. Витримували 15 хв. на льду і центрифугували при 10000 g 5 хв. при 4˚С. Відбирали шприцом надосад так, щоб не зачепити залишки того, що не осіло. І додатково фільтрували через фільтр Synpor з діаметром пор 0,3 мм. До відібраного надосаду додавали 15 мл ізопропанолу, витримували 10 хв. і центрифугували при 15 000 g 10 хв. Відбирали рідину і залишали пробірки підсохнути при кімнатній температурі. Осад розчиняли у 400 мкл TE і додавали 400 мкл холодного 5.0 М LiCI. Центрифугували при 10000 g 5 хв. До надосаду, який ми відбирали після центрифугування, додавали 1 мл ізопропанолу, інтенсивно перемішували і ставили в холодильник на -20˚С на 5хв. Надалі вміст пробірки центрифугували при 18000 g протягом 5 хв. Супернатант обережно видаляли, осад промивали у 500μl ТЕ із додаванням 2 мкл РНКази і залишали на 30 хв. при кімнатній температурі. До суміші додавали 500 мкл суміші фенол: хлороформ: ізоаміловий спирт(25:24:1), інтенсивно перемішували і центрифугували при 10000 g 5 хв. Обережно відбирали верхню фазу в чисті пробірки. ДНК із водної фази осаджували трьома об’ємами 96% етанолу і центрифугували при 18.000 g 10 хв. Осад промивали 70 % етанолом і центрифугували декілька хвилин при 13400 g. Супернатант обережно видаляли, осад висушували при 50˚С до повного випаровування етанолу і розчиняли в 30 мкл води.