2.2.8. Підготовка до проведення in vitro транскрипції
Для отримання необхідного фрагменту гена люциферази проводили лінеаризацію через рестрикцію за сайтом для EcoR I рестриктази (рис. 2.2).
Рис. 2.1. Етапи маніпуляцій з плазмідою pGEM - 3Z для отримання РНК гена люциферази
Рестрикцію проводили рестриктазою EcoR I, яка не утворює 3`- виступаючий кінець. Рестрикцію проводили в об’ємі 100 мкл, до якого входили 4 мкл ДНК (5 мкг/ мкл), рестриктаза , 10х-буфер і вода. ДНК очищали за допопмогою кіта GeneJET PCR Purification Kit. Опісля виміряли концентрацію і проводили електрофорез.
2.2.9. Іn vitro транскрипція
Транскрипцію проводили в об’ємі 50 мкл. До розчину ДНК 1 мкг/15 мкл у воді, обробленій DEPC, додавали ATP/GTP/CTP/UTP Mix (фінальна концентрація кожного нуклеотида 2 mM), інгібітора РНКази, SP6 РНК-полімеразу, 5х-буфер. Інкубували 2 години при 37ºС. Після цього додавали послідовно ДНКазу, інкубували 15 хв. при 37˚С і додавали ???? 0,5 M EDTA і інкубували 10 хв. при 65˚С.
Після цього транскрипційну суміш піддавали фенол/хлороформній депротеїнізації. До супернатанту додавали ізопропанол, витримували впродовж 15 хв. при -20˚С і центрифугували 15 хв. 18000 g. Відбирали супернатант і додавали до нього 70% етанолу. Центрифугували 3 хв. 13.400 g. Осад РНК розчиняли у воді і проводили електрофорез вуденатуруючому гелі.
2.2.10. Культивування експлантів
Після отримання плацентичастину плаценти заморозили відразу в рідкому азоті («свіжа» плацента), а решту транспортували на льоду до лабораторії. Потім готували з неї експлантитакультивували.Для цього зразкипромиваливід крові в охолодженому стерильному фізіологічному розчині (0,9% NaCl), забуференому фосфатами (PBS, pH 7,2). Від тканини хірургічними ножицями відділяли шматочки 1-3 мм з ворсинками хоріону і відбирали експланти діаметром 3-4 мм. Їх переносили у плашки або чашки Петрі з культуральним середовищемDMEM/Ham`s-F12з антибіотиками стрептоміцином, біциліном і канаміцином (по 0,1 мг/мл кожного). Експланти культивували в інкубаторі з 5% СО2 і 21 % СО2 при 37 °С протягом 12, 18 і 24 годин. До деяких експлантів при культивуванні додавали гомоцистеїн в кількості 10, 20 або 40 µl. Після культивування експланти зважували та заморожували.
2.2.11. Виділення рнк
Для виділення РНК шматок тканини (масою 50-100 мг) та експланти гомогенізували в ступці з рідким азотом до порошкоподібного стану, додаючи по 1 мл реагенту Trizol. Після розтавання відбирали суміш гомогенату з Trizol. Центрифугували 10 хв при 12000×g за температури 4ºC. Після центрифугування відбирали надосадову рідину. Додавали 200 мкл хлороформу, інтенсивно перемішували та інкубували на льоду протягом 2 хв. Суміш центрифугували 10 хв при 12000×g за температури 4 ºC. Відбирали водну фазу, до неї додавали 500 мкл ізопропанолу, перемішували та інкубували 10 хв на льоду. РНК осаджували центрифугуванням протягом 10 хв при 12000×g за температури 4 ºC. Надосадову рідину видаляли, додавали 1 мл охолодженого 70% етанолу на DEPC-воді, перемішували і центрифугували протягом 15 хв при 10000×g за температури 4ºC. Надосадову рідину видаляли, РНК в осаді підсушували за кімнатної температури та розчиняли у 30-50 мкл води. Концентрацію та чистоту препаратів визначали спектрофотометром за оптичною густиною при λ = 260 нм та за відношенням оптичної густини при 260/280 та 260/230.