Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
По составу ферментативного комплекса препараты Г10х существенно отличаются от культуральной жидкости. Технология их выделения оптимизируется по основному ферменту, тогда как сопутствующие ферменты в различной степени отделяются на стадиях предварительной очистки культуральной жидкости, ее фильтрации и осаждении
ферментов органическими растворителями. Некоторые технологии
препаратов Г10х включают стадии инактивации сопутствующих ферментов, например, путем изменения рН среды. В основном препараты
именно этой категории используются в отраслях легкой и химической
промышленности, в частности в ферментативных операциях по выделке кожи и меха.
Препараты с индексом Г20х получают с применением ультрафильтрации, т. е. способа концентрирования, основанного на разделении вещества различной молекулярной массы с помощью полупроницаемых мембран с определенным размером пор. Ультрафильтрации
подвергают предварительно очищенные ферментные растворы, свободные от клеток организмов и взвешенных частиц. Культуральную
жидкость очищают и фильтруют так же, как при получении препаратов
Г10х. Фильтрат дополнительно очищают с помощью стерилизующей
фильтрации, после чего направляют на ультрафильтрацию. На стадии
ультрафильтрации из ферментного раствора удаляются низкомолекулярные компоненты (соли, сахара, пигменты) и белки с эффективным
радиусом молекул меньше радиуса пор мембраны.
Из ультраконцентратов получают жидкие и сухие формы ферментных препаратов. Первые стабилизируют консервантами (бензойной кислотой). Вторые получают путем распылительной сушки, перед
которой в концентрат вносят стабилизаторы и наполнители.
Препараты Г20х применяют при производстве пищевых продуктов и напитков, в кормопроизводстве, в составе медикаментов.
Препараты с индексом Пх представляют собой высушенные
культуры грибов-продуцентов ферментов, полученные при твердофазном культивировании. Они сохраняют полный ферментативный комплекс продуцентов, не очищены и имеют высокую микробную обсемененность. Применяются аналогично препаратам Г3х.
Препараты с индексами П10х и П20х получают из свежих или
высушенных твердофазных культур грибов по следующей схеме: водная экстракция ферментов из культуры гриба – отделение экстракта –
осаждение ферментов из экстракта этиловым или изопропиловым
спиртом – отделение ферментного осадка, суспендирование осадка
81
в воде – добавление к суспензии стабилизаторов и наполнителей –
сушка суспензии распылением. Препараты П10х применяют аналогично Г10х, П20х – аналогично Г20х.
Препараты с индексом П20х получают по следующей схеме:
экстракция ферментов из твердофазной культуры – стерилизующая
фильтрация экстракта – ультрафильтрация – стандартизация и стабилизация ультраконцентрата – сушка его распылением. Препараты применяют аналогично препаратам Г20х.
Перечисленные виды ферментных препаратов относятся к растворимым, т. е. к препаратам, активная часть которых растворяется в водной
среде. По окончании обработки она остается в реакционной среде и вторично не используется. Наряду с растворимыми выпускают также иммобилизованные ферменты. Иммобилизация – это включение объекта в изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна с ней обмениваться молекулами (субстратов, эффекторов).
Иммобилизованные ферменты получают путем связывания с
носителями растворимых ферментов или клеток микроорганизмов, обладающих ферментативной активностью. Наиболее распространенные
способы связывания – это сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей. Иммобилизация приближает условия функционирования ферментов к природным. В природе большая часть ферментов ассоциирована со структурами живых
организмов или элементами окружающей среды, что важно для проявления активности ферментов и их стабильности.
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ перед растворимыми. Их можно изъять из реакционной среды, что позволяет контролировать ход ферментативной реакции и многократно использовать
ферментные препараты. Каталитический процесс можно проводить
непрерывно, пропуская растворы субстратов через реакторы с иммобилизованными ферментами. Продукты реакции не загрязняются примесями
ферментных препаратов. Иммобилизованные ферменты имеют высокую
операционную стабильность, а их каталитические свойства можно модифицировать, изменяя способ связывания и вид носителя.
Применение иммобилизованных ферментов позволило решить
задачу создания крупных промышленных биокаталитических процессов, с помощью которых производят аминокислоты, органические кислоты, сахара, растворители, антибиотики, гормональные препараты,
проводят очистку сточных вод и водоемов, биоконверсию органических отходов.
82
Вопросы и задания
1. Чем отличаются выпускаемые ферментные препараты? Как
это отражается в их названии?
2. Как разделяют ферментные препараты, получаемые с помо-
щью микробного синтеза?
3. Какой активностью должны обладать препараты с индексом
Г3х в сравнении с препаратами Гх? Как их получают?
4. Как получают ферментные препараты с индексом Г3х-Ф?
5. Какие препараты имеют индекс Г10х?
6. Какие препараты ферментов получают с применением метода
ультрафильтрации? В каких отраслях промышленности они используются?
7. Какой консервант наиболее часто используют для стабилиза-
ции ферментов?
8. Какие препараты обозначаются индексом Пх?
9. Как получают препараты с индексом П10х и П20х?
10. Какие препараты, полученные с помощью поверхностного
культивирования микроорганизмов, применяют аналогично ферментам
с индексами Г20х?
11. Что такое иммобилизованные ферменты?
12. Как получают иммобилизованные ферменты?
13. Какие наиболее распространенные способы связывания
фермента с носителем?
14. Какие преимущества имеют иммобилизованные ферменты в
сравнении с нативными?
15. В каких отраслях производства применение иммобилизованных ферментов позволило решить задачу создания крупных промышленных биокаталитических процессов?
83
10. ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Действие ферментов определяют различными методами, кото-
рые можно условно разделить на четыре группы:
1 – по уменьшению количества субстрата или полному его расщеплению при действии минимального количества фермента. За исчезновением субстрата наблюдают путем определения сухого остатка, по
разности в высоте отцентрифугированных осадков до и после действия
фермента.
2 – по изменению свойств среды функционирования фермента
путем измерения вязкости, оптического вращения, электропроводности, поверхностного натяжения, объема, показателя преломления, мутности.
3 – спектрофотометрическим, колориметрическим, поляриметрическим определением аминных, карбоксильных групп, общего азота
и молекулярной массы продуктов реакции.
4 – путем исследования свойств субстрата (шкуры) дифференциально-термическим, микроскопическим и другими методами,
а также по выплавляемости желатина из дермы шкуры после действия
фермента на коллаген.
Активность ферментов – способность в разной степени ускорять
реакцию. Активность ферментных препаратов выражается в условных
единицах, измеряемых при определенных параметрах: концентрации
субстрата и фермента, температуре, рН и длительности воздействия.
Числовые выражения активности для одного и того же препарата могут
быть различными в зависимости от метода ее определения.
Активность выражают:
1) в международных единицах активности – (МЕ). Она представляет такое количество фермента, которое при заданных условиях
катализирует превращение за 1 мин 1 микромоля субстрата или 1 микроэквивалента затронутых реакцией групп. Т. е. за меру скорости принимается либо общее число подвергшихся расщеплению молекул, либо
число расщепленных связей;
2) в 1973 г. была введена новая единица ферментативной активности, которая получила название катал (кат). Она соответствует количеству катализатора, способного превращать 1 моль субстрата
84
в продукт за секунду. Международная единица ферментативной активности Е связана с каталом следующими равенствами:
1 кат = 1 моль субстрата . с
−1
= 60 моль . мин
−1
=
= 60 . 106 мкмоль . мин −1 = 6 . 107 Е.
Соответственно 1 Е = 16,67 нкат;
3) в единицах удельной активности – число единиц активности
(любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе
белка в этом образце. Она непосредственно зависит от степени чистоты
препарата;
4) реже используют молярную активность – количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту.
Концентрацию фермента в растворе выражают в стандартных
единицах на один миллилитр.
Активность протеолитических ферментов можно определять по
расщеплению казеина. В кожевенной промышленности пользуются казеиновым числом, которое выражается в граммах казеина, расщепляемого в течение одного часа одним килограммом испытуемого препарата фермента. Например, 0,8 г препарата фермента расщепили 0,5 г казеина, тогда казеиновое число будет равно
0,5 ∙ 1000/0,8 = 625.
При мягчении голья в кожевенном производстве используется
метод осаждения, суть которого заключается в следующем: в раствор
казеина с ферментом после выдержки в течение часа добавляют соляную кислоту. Продукты расщепления казеина – казеозы, в отличие от
самого казеина, не взаимодействуют с кислотой, поэтому сравнение количества соляной кислоты, находящейся в испытуемом и контрольном
растворах, дает возможность определить степень расщепления казеина.
Активность препарата в данном случае выражают в миллилитрах децинормальной щелочи.
В меховом производстве при проведении квашения используют
метод определения диастатической силы муки и выражают ее количеством мальтозы, образующейся в течение 1 ч при 27 °С под действием
диастатических ферментов, которые содержатся в муке. Под действием
протеолитических ферментов муки на пептидные связи увеличивается
содержание аминного азота в растворе, определяя который находят
протеолитическую активность муки.
85
При анализе солодовых ростков, применяемых для квашения,
протеолитическую активность находящихся в них ферментов определяют методом разжижения желатина путем сравнения его вязкости до
и после воздействия солодовой вытяжки.
Таким образом, активность ферментных препаратов, в первую
очередь, определяется концентрацией и характеристиками входящих в
них ферментов. Соответственно скорости ферментативных реакций,
как было отмечено ранее, зависят от условий их протекания: температуры, реакции среды, наличия активаторов и ингибиторов.
Вопросы и задания
1. Перечислите основные методы, с помощью которых опреде-
ляют действие ферментов.
2. Дайте определение активности ферментов.
3. В чем выражают активность ферментов?
4. Как связана международная единица ферментативной актив-
ности с каталом?
5. Как выражают концентрацию ферментов в растворе?
6. По расщеплению какого белка можно определить активность
ферментов?
7. Какой метод определения активности ферментов использу-
ется при мягчении голья в кожевенном производстве?
8. Какой метод определния активности ферментов применяют в
меховом производстве при проведении квашения?
9. Чем в первую очередь определяется активность ферментных
препаратов?
10. От чего зависят скорости протекания ферментативных реакций?
86
11. Д ЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ НА ОСНОВНЫЕ
КОМПОНЕНТЫ ШКУРЫ
1 1 . 1 . О с н о в н ы е к о м п о н е н т ы ш к у р ы
Шкура животных по химическому составу и структурному
строению чрезвычайно разнообразна. По химическому составу она состоит преимущественно из органических веществ: белков, липидов
(жироподобных веществ), углеводов (моносахаридов – глюкозы и лактозы, гомополисахарида – гликогена, гликозамингликанов, называемых ранее мукополисахаридами), ферментов и витаминов. Из неорганических веществ в шкуре содержатся вода и минеральные вещества.
Глобулярные белки представлены простыми белками – альбуминами и глобулинами, а также многочисленной группой сложных белков,
имеющих в составе различные небелковые компоненты. В процессах консервирования шкур мокросолением, а также при отмоке простые белки
межволоконного вещества почти полностью удаляются из шкур.
Характерной особенностью альбуминов является значительное
содержание в них серы. Они растворяются в воде, в разбавленных растворах солей, кислот и щелочей, из которых они могут быть осаждены
концентрированными кислотами и щелочами.
Глобулины нерастворимы в воде, но растворяются в растворах
нейтральных солей (8–10 % растворе NaCl), слабых растворах кислот
и щелочей.
Сложные белки межволоконного вещества представлены:
− фосфопротеинами, входящими в состав клеточных ядер;
− хромопротеинами, входящими в состав крови;
− липопротеинами, распределенными по всей толще шкуры;
− гликопротеинами, связанными с углеводами и являющимися
важнейшей составной частью межволоконного вещества.
Почти все сложные белки растворимы в растворах слабых щелочей, в частности в полунасыщенном растворе гидроксида кальция.
Гликопротеины содержат олигосахаридные (гликановые) цепи,
ковалентно присоединенные к полипептидной основе. Роль олигосахаридных цепей в функции гликопротеинов точно не определена, несмотря на интенсивное изучение этого вопроса.
87
Однако можно перечислить некоторые предполагаемые их
функции:
− моделирование физико-химических свойств, таких как рас-
творимость, вязкость, заряд и денатурируемость;
− осуществление защиты от протеолиза;
− влияние на протеолитичесий процессинг белков-предше-
ственников;
− участие в биологической активности.
В состав межволоконного вещества также входят углеводные
компоненты, которые связаны различными связями с его белками.
В основном это гликозамингликаны, представляющие собой полисахариды, построенные из повторяющихся дисахаридных компонентов, содержащих аминосахара (глюкозамин или галактозамин в сульфированном или не сульфированном виде, связанные -глюкозидной связью
с уроновой кислотой). Раньше глюкозамингликаны называли мукополисахаридами. Они обычно ковалентно связаны с белком. Комплекс одного или более гликозамингликана с белком называют протеогликаном. Именно протеогликаны являются доминирующим компонентом
основного вещества межклеточного матрикса и выполняют функцию
межволоконного наполнителя. Поэтому их также называют коровыми
белками (core – сердцевина, стержень). Молекулы протеогликанов
имеют наиболее крупные размеры (свыше 2000 кДа) и содержат белковую (5 % по массе) и углеводную (95 %) составляющие. По форме они
напоминают ершик для мытья бутылок.
Гликопротеины и протеогликаны часто относят к классу сложных углеводов. Различие между ними состоит в химической природе
присоединенных к белку полисахаридов. Следует отметить, что белки
соединительных тканей или внеклеточного матрикса часто подразделяют на три основные группы: это уже упоминавшиеся протеогликаны,
фибриллярные структурные белки (семейства коллагена и эластина),
а также фибриллярные адгезивные белки (семейства фибронектина
и ламинина). Все они содержат углеводы, поэтому относятся к сложным белкам и представляют собой белково-углеводные комплексы.
Межволоконное вещество сильно гидратировано и содержит
много инонов Na+. Гликозамингликаны, как основное скрепляющее вещество, связаны со всеми структурными компонентами, в том числе с
коллагеном и эластином. Их функция состоит в удержании большой
массы воды и в заполнении межклеточного пространства. Они служат
88
пластифицирующим материалом для разного рода тканевых структур.
Выполнению этих функций способствует большое число –ОН групп и
отрицательных зарядов на их молекулах, что приводит к взаимному отталкиванию углеводных цепей, препятствует их слипанию. Основными
гликозамингликанами межволоконного вещества являются гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат.
Гиалуроновая кислота представляет собой неразветвленную
цепь из повторяющихся дисахаридных компонентов, содержащих
β-глюкуроновую кислоту и N-ацетилглюкозамин (рис. 11.1). Твердые доказательства связи гиалуроновой кислоты с молекулой белка
(которые имеются для других полисахаридов соединительной
ткани) отсутствуют, но, вероятно, эта кислота подобно другим гликозаминогликанам, синтезируется в составе протеогликанов. Гиалуроновая кислота широко распространена в рыхлой соединительной ткани животных.
Рис. 11.1. Составное звено гиалуроновой кислоты
Хондроитинсульфаты являются протеогликанами, в которых
полисахарид связывается с белком О-гликозидной связью. Повторяющийся дисахаридный компонент очень сходен с таковым в гиалуроновой кислоте. Но вместо N-ацетилглюкозамина здесь присутствует
N-ацетилгалактозамин, содержащий сульфатный заместитель в положении 4 или 6 (рис. 11.2).
89
Рис. 11.2. Составное звено хондроитинсульфата
На дисахаридную единицу приходится в среднем примерно
один сульфатный заместитель. Каждая полисахаридная цепь содержит
около 40 повторяющихся дисахаридных компонентов и имеет молекулярную массу, близкую к 20 кДа. В результате связывания множества
таких цепей с одной белковой молекулой образуются высокомолекулярные протеогликаны.
Хондроитинсульфаты прочно связываются с гиалуроновой кислотой при помощи двух адгезивных или связывающих белков, образуя
в соединительной ткани очень большие агрегаты (рис. 11.3).
Широко распространен в тканях животных и дерматансульфат.
По структуре он сходен с хондроитинсульфатом. Но отличается тем,
что вместо глюкуроновой кислоты, соединенной с ацетилгалактозамином -1,3-связью, он содержит в ряде дисахарных единиц идуроновую
кислоту, соединенную с тем же гексозамином -1,3-связью.
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]