Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
плесневого гриба A. oryzae, полученная в кристаллическом виде, имеет
молекулярную массу около 52 кДа.
В зависимости от вида микроорганизма свойства α-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат
и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления
максимальной активности. Температурный оптимум действия α-амилаз
может находиться от 45 до 80 °С, а оптимальный рН – от 4,5 до 7.
Все α-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу
концевых связей в субстрате. Однако ряд -амилаз грибного
происхождения гидролизуют субстрат более глубоко с образованием
небольшого количества мальтозы и глюкозы. Таким образом, гидролиз под
действием -амилазы можно представить следующим образом (рис. 7.3).
Рис. 7.3. Гидролиз под действием -амилазы
-Амилаза (КФ 3.2.1.2) – фермент, обладающий свойствами аль-
бумина. Каталитический центр фермента содержит сульфгидрильные и
карбоксильные группы, а также имидазольный цикл остатков гистидина.
-Амилаза – экзофермент концевого действия. В отличие от α-амилазы,
она не гидролизует нативный крахмал. Клейстеризованный крахмал гидролизуется -амилазой с образованием мальтозы -конфигурации, поэтому по аналогии с α-амилазой она и называется -амилазой.
Действие -амилазы можно записать в виде следующей схемы
(рис. 7.4).
Рис. 7.4. Гидролиз под действием -амилазы
71
-Глюкозидаза (КФ 3.2.1.20). Фермент способен гидролизовать
концевые -1,4-связи с отщеплением остатка глюкозы. -Глюкозидаза
проявляет наибольшую активность к низкомолекулярным субстратам,
легко гидролизует мальтозу и олигосахариды. Полисахариды гидролизует медленно или вовсе на них не действует.
-Глюкозидаза очень похожа на глюкоамилазу, но у нее есть
отличительные особенности: глюкоза отщепляется ей в -D-форме,
а при действии глюкоамилазы в -D-форме. Кроме того, -глюкозидаза
обладает высокой трансферазной активностью, поэтому в реакционной
среде обнаруживаются изосахара. -Глюкозидазы проявляют высокую
специфичность только к последнему с нередуцирующего конца остатку
глюкозы, поэтому этот фермент может успешно действовать
на производные глюкозы.
Ферменты, обладающие гликозидазной активностью, способствуют удалению из шкур межволоконного вещества и некоторому разделению структурных элементов коллагена. Их применяют в основном
в меховом производстве. Важную роль указанные ферменты играют
в процессе квашения мехового сырья.
Кроме ферментов класса гидролаз, в меховом производстве при
отбеливании волосяного покрова и окислительном крашении могут использоваться ферменты первого класса – оксидоредуктазы.
Вопросы и задания
1. Какие подклассы какого класса ферментов чаще всего использульзуются в ферментативных процессах кожевенного и мехового
производства?
2. К какой группе относятся протеолитические ферменты? Какую реакцию они катализируют?
3. По какому принципу протеолитические ферменты разделяли
на протеиназы и пептидазы?
4. Что из себя представляют эндо- и экзопептидазы? Приведите
примеры эндо- и экзопептидаз.
5. В соответствии с какой специфичностью классифицируют
пептидазы?
6. В связи с какими особенностями классифицируют протеиназы?
7. К какой группе ферментов относится трипсин. Приведите его
основные характеристики.
8. Какие белки легко подвергаются действию трипстна?
72
9. Какие связи гидролизует трипсин?
10. В каком виде трипсин применяется при мягчении голья в кожевенном производстве?
11. Что такое химотрипсиноген?
12. Какие связи гидролизуются под действием химотрипсина?
13. Приведите основные характеристики панкреатоппептидазы.
14. Что из себя представляют субтилизины?
15. Какие ферменты содержит препарат Проназа?
16. Какие ферментные препараты на основе сериновых протеиназ животного и микробного происхождения вы знаете?
17. Приведите основные характеристики тиоловых протеиназ.
18. Какие три группы катепсинов выделяют в зависимости от
строения активного центра? Какие из них наиболее многочисленные?
19. Механизм действия катепсина.
20. Приведите примеры тиоловых протеиназ растительного
происхождения. Источники их получения и спектр действия.
21. Что из себя представляют карбоксильные протеиназы?
22. При каких условиях и как действует пепсин?
23. Пепсины какого происхождения входят в состав комплексных ферментных препаратов?
24. Как называется высокоспецифический фермент, расщепляющий в щелочной среде нативный коллаген на пептиды без образования аминокислот? Опишите один из способов его получения?
25. Приведите классификацию эстераз. Какие ферменты относятся к подподклассу 3.1.1?
26. Как вы понимаете термин «межфазная активация»?
27. Приведите примеры липаз различного происхождения и их
основные характеристики.
28. Приведите примеры различных источников гликозидаз.
29. Какие реакции катализирует α-амилаза?
30. Какую роль в молекуле α-амилаз выполняет Са?
31. Схематически изобразите гидролиз крахмала (гликогена)
под действием α-амилазы.
32. Чем отличается действие β-амилазы от α-амилазы?
33. Какие реакции катализирует α-глюкозидаза? Какие у этого
фермента отличительные особенности?
34. Как применяются ферменты, обладающие гликозидазной
активностью в меховом производстве?
35. Какие еще ферменты могут применяться в меховом производстве при отбеливании волосяного покрова и окислительном крашении?
73
8 . ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ
Долгое время вполне обоснованно считали, что все ферменты –
тела белковой природы. Однако в начале 80-х гг. была неожиданно открыта способность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превращения предшественников РНК в функционально
значимый продукт, т. е. возникло представление о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами.
Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов –
рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома С, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов – это выделение их из биологических объектов.
Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные
свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий
в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше
−10 °С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу
относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию
ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию энзимологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов
разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. В основе последнего метода положено разделение белков по их изоэлектрическим точкам. Для создания
градиента рН используют амфолины – смесь полиаминополикарбоновых кислот. Стабилизирующим агентом служит полиакриламидный
гель (ПААГ). Преимуществами метода являются высокая точность
и возможность оперирования малым количеством белка (100–200 мкг).
Одна из модификаций адсорбционного метода – афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюирует
с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в тысячи раз,
74
применяя всего лишь одноэтажную (аффинная сорбция – элюция)
схему выделения.
Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала,
вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий,
ядер и др. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка,
так как она всегда связана с потерей ферментативной активности.
Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона,
меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.) (рис. 8.1).
Рис. 8.1. HS-содержащие соединения
Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов
низкую температуру для предотвращения их возможной инактивации.
Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают
к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие их способности кристаллизоваться.
А. Д. Розенфельд впервые в 1906 г. получил в виде кристаллов оксидазу
из корней редьки. Затем последовали в 1926 г. приобретшие широкую
известность работы Д. Самнера по получению кристаллической уреазы
из бобов канавалии.
Нередко о степени чистоты ферментного препарата судят по его
биологической активности: если активность при дальнейшей очистке не
возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из более чем 2000
включенных в список ферментов, свыше 1500 выделено и в той или иной
мере очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен
выяснена первичная, а у нескольких десятков – третичная структура.
Ферментные препараты могут быть получены в виде порошков
и сиропов.
Активность ферментных препаратов сохраняется только в сухом виде. Если работа с ферментами проводится в течение длительного
75
времени, к ним добавляют антисептики, при выборе которых следует
учитывать возможность инактивации фермента.
Протеолитические ферменты синтезируются практически
всеми живыми существами, поэтому в промышленных целях как источник получения протеиназ используются животные ткани, растения и
микроорганизмы. Животными тканями для получения протеиназ является собираемое на мясокомбинатах ферментное сырье, состоящее из
поджелудочной железы и слизистой оболочки желудка. Из растений
промышленный интерес представляют плоды дынного дерева, побеги
и листья инжира, отходы переработки ананасов.
Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы – бактерии, микроскопические грибы и актиномицеты.
До развития ферментной промышленности главным источником получения амилолитических ферментов было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья.
В настоящее время главным промышленным источником амилаз являются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.
Липолитические препараты могут быть получены из животных
тканей, семян некоторых растений и микроорганизмов. Бактерии, как
правило, накапливают внутриклеточную липазу, актиномицеты, грибы
и дрожжи – преимущественно внеклеточную.
Поскольку как животное, так и растительное сырье уже не может в полной мере удовлетворить растущую потребность различных
отраслей промышленности в гидролазах, наиболее перспективным их
источником являются микроорганизмы.
Вопросы и задания
1. О какой природе некоторых ферментов было открыто пред-
ставление в начале 80-х гг. предыдущего столетия?
2. Приведите примеры ферментов для которых уже осуществ-
лен лабораторный синтез?
3. Почему перспективы широкого распространения синтетического
получения ферментов весьма ограничены в ближайшие десятилетия?
4. Каковы особенности выделения ферментов в сравнении с вы-
делением обычных белков?
5. Какие вещества могут применяться при выделении ферментов
для исключения возможности потери их ферментативной активности?
76
6. К каким методам прибегают для оценки гомогенности полу-
чаемых ферментных препаратов при выделении ферментов?
7. При каком характере изменения активности ферментного
препарата при дальнейшей его очистке можно предположить, что он
гомогенный?
8. В чем опасность применения антисептиков в создании рецептур препаратов ферментов с длительным сроком хранения?
9. Какой источник ферментов является наиболее перспективным на сегодняшний день?
10. В каком виде активность ферментных препаратов сохраняется лучше всего?
77
9 . М ИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТНЫЕ
ПРЕПАРАТЫ СЫРЬЯ
Выпускаемые ферментные препараты различаются по методам
культивирования фермента, способам концентрирования и очистки.
Многие виды отечественных ферментных препаратов имеют названия
и индексы, несущие информацию о продуценте фермента, основной активности и способе выделения препарата. Название таких препаратов
состоит из двух частей: первая соответствует виду основной активности, вторая – видовому названию продуцента. Например, Амилосубтилин – это препарат α-амилазы из культуры B. Sutilis, Глюкаваморин –
препарат глюкоамилазы из Asp. Awamori.
По условиям проведения процесса различают поверхностный
метод культивирования (выращивания) сырьевых микроорганизмов на
подложке из питательных сред (в основном для выращивания каллусных культур растений) и метод глубинного культивирования в объеме
жидких питательных сред (преимущественно в процессах микробной
биотехнологии). Примерная схема получения микробиологических
ферментных препаратов изображена на рис. 9.1.
Препараты, выделенные из культуры глубинного культивирования, имеют в индексе букву «Г», поверхностного или твердофазного – «П». Далее следует цифровой индекс, характеризующий степень
концентрирования фермента в препарате по отношению к культуральной жидкости или твердофазной культуре. Индексом Гх обозначается
неочищенная культуральная жидкость, которая преимущественно используется на месте выработки.
Препараты с индексом Г3х должны иметь активность в ед./г
в три раза выше, чем средняя активность культуральной жидкости
в ед./мл. Их получают путем распылительной сушки, концентрированной культуральной жидкости. Концентрирование проводят методом вакуум-выпаривания при температуре, не вызывающей инактивации фермента (не выше 30 °С). При необходимости перед упариванием в культуральную жидкость добавляют стабилизаторы и регулируют величину
рН, а перед сушкой – соли-наполнители, с целью снижения механических потерь при сушке. В качестве солей обычно используют поваренную соль, количество которой составляет не менее 100 % от массы сухих веществ концентрата. Сушку проводят при температуре на входе
в сушилку до 140 °С, на выходе – 70 °С.
78
Рис. 9.1. Схема получения микробиологических ферментных
препаратов
79
Распыляемый продукт подвергается воздействию высокой температуры в течение долей секунды. Но и этого часто бывает достаточно
для частичной термоинактивации фермента. Поэтому в концентрат добавляют агенты, повышающие термостабильность ферментов. Высушенный препарат стандартизуют либо той же поваренной солью, либо
иными наполнителями.
Препараты с индексом Г3х являются неочищенными и имеют
высокую степень микробной обсемененности, порядка 10
10
спор или
клеток в 1 г. Это существенно ограничивает их сферу применения.
В микробиологической промышленности их используют для гидролиза
компонентов питательных сред.
Препараты с индексом Г3х-Ф получают путем распылительной
сушки концентрированного фильтрата культуральной жидкости. Они
являются частично очищенными, так как при фильтрации удаляется
биомасса и часть балластных веществ. Активность препаратов Г3х-Ф
выше, чем Г3х. В пищевой промышленности их используют наряду с
более чистыми Г10х.
Индекс Г10х имеют препараты, полученные путем осаждения
органическими растворителями из концентрированных фильтратов
культуральной жидкости. Перед фильтрацией жидкость обрабатывают
минеральными или органическими коагулянтами, что позволяет в процессе разделения фаз освободить фильтрат от биомассы микроорганизмов, балластных белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот. Фильтрат концентрируют вакуум-выпариванием, добавляя при необходимости стабилизирующие агенты. Из концентрированного фильтрата ферменты осаждают органическими растворителями (этанолом, изопропанолом, их смесью, ацетоном). При этом происходит фракционирование
белков ввиду их полидисперсности по молекулярной массе в зависимости от изоэлектрической точки и гидрофильности. Ферментный осадок
отделяют от жидкой фазы и высушивают в вакуумной или распылительной сушилке. В первом случае высушенный продукт измельчают,
стандартизируют, добавляя наполнители. Вид наполнителя определяется назначением препарата (соль, крахмал, мука).
Препараты Г10х имеют значительно более высокую чистоту,
чем Гх, Г3х, и Г3х-Ф. Это выражается как в активности ферментов на
1 г препарата, так и в удельной активности на 1 мг белка. Микробная
обсемененность препаратов Г10х регламентируется на уровне
104–105 спор или клеток в 1 г.
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]