Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
6 . 4 . К о н ц е н т р а ц и я ф е р м е нта
При определенных условиях скорость ферментативной реакции
прямо пропорциональна концентрации фермента. Это бывает не всегда,
что можно проиллюстрировать на примере прямой реакции, идущей
в равновесных условиях. Даже если мы знаем, что прямая реакция идет,
будет казаться, что скорость ее равна нулю, поскольку с такой же скоростью идет обратная реакция. Когда же ферментативная реакция
только начинается, продукт еще практически отсутствует, и обратная
реакция не идет. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата соответствует его исходному количеству. Поэтому
начальная скорость реакции (v), будет прямо пропорциональна концентрации фермента [Е]. Фермент является реагентом, который, соединяясь с субстратом, образует фермент-субстратный комплекс Е─S, распадающийся на свободный фермент и продукт Р. В простейшей форме
можно записать
k1
Е + S ↔ Е + Р.
k
−1
Хотя в выражения для скоростей прямой и обратной реакций
входит [Е]:
скорость1 = k1 [Е][S];
скорость−1 = k
[Е][Р],
−1
в выражении для константы равновесия [Е] уже не содержится:
kр = k1/ k
= [Е][Р] / [Е][S] = [Р] / [S].
−1
Таким образом, концентрация фермента не оказывает влияния
на константу равновесия kр. В свою очередь kр, не зависит от того, каким образом достигается равновесие: с участием фермента или без
него. Фермент меняет путь, по которому идет реакция, но не конечные
(равновесные концентрации) реагентов и продуктов, от которых зависят kр и G °
41
6 . 5 . К о н ц е н т р а ц и я с у б с т р а т а
При увеличении концентрации субстрата [S] и сохранении всех
остальных условий начальная скорость v (скорость, измеряемая в период, когда израсходована незначительная доля субстрата) будет повышаться до максимальной величины V
, после чего остается постоян-
max
ной (рис. 6.3).
Рис. 6.3. Влияние концентрации субстрата на скорость
ферментативной реакции
По мере повышения концентрации субстрата скорость реакции
будет расти до тех пор, пока не произойдет насыщения фермента субстратом. В таких условиях v уже не будет возрастать при дальнейшем
повышении концентрации субстрата. Здесь следует отметить, что большинство ферментативных реакций ввиду огромной разницы между молекулярными массами субстрата и фермента проходят при значительном
молярном избытке субстрата по отношению к ферменту, достигающем
величины 106. Это значит, если [S] уменьшить в 100 раз, его концентрация все еще в 10000 раз будет превышать концентрацию фермента.
Ситуация, соответствующая точкам А, В и С, проиллюстрирована на рис. 6.3.
В точках А и В в комплексе с субстратом находится лишь часть
молекул фермента, хотя концентрация молекул субстрата значительно
выше. Это происходит потому, что константа равновесия реакции
Е + S ↔ Е – S
42
хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках А и В повышение
или понижение [S] будет приводить к увеличению или уменьшению
доли молекул Е, связанных с S (т. е. доли молекул Е – S), и v будет зависеть от [S]. В точке С практически все молекулы фермента связаны с
субстратом, и дальнейшее повышение [S], хотя и повысит частоту
столкновений Е с S, не сможет привести к повышению скорости реакции, поскольку молекул фермента свободных от субстрата уже не осталось. Случай В, когда половина молекул фермента насыщена субстратом, представляет собой теоретический интерес. Соответственно, скорость реакции равна половине максимальной скорости (V
/2), дости-
max
жимой при данной концентрации фермента.
Состояния А, В, и С (рис. 6.4) отвечают соответствующим точкам на кривой, представленной на рис. 6.3.
Рис. 6.4. Связывание субстрата ферментом при низкой (А), высокой
(С) концентрации субстрата, а также при концентрации
субстрата, равной Км (В)
6 . 6 . У р а в н е н и е М и х а э л и с а – М э н т е н
Гиперболическая зависимость в координатах v–1 [S] выражается уравнением Михаэлиса–Мэнтен, которое получается в результате
следующих рассуждений. При рассмотрении реакции превращении
субстрата S в продукт Р при участии фермента Е можно выделить три
реакции:
43
k
+1 k+2
S + E ↔ ES →E + P, (6.1)
k
−1 _
где k+1, k
– соответственно константы скоростей прямой реакции об-
−1
разования комплекса ES и обратной реакции его диссоциации; k+2 –
константа скорости образования конечного продукта.
Равновесное состояние для промежуточного продукта достигается
очень быстро, что означает равенство скоростей образования и распада ES ,
и соответственно, неизменность его концентрации во времени. Поэтому
условие стационарности можно представить в следующем виде:
k+1[E][S] − k−1[ES] − k+2[ES] = 0. (6.2)
Обозначим общую концентрацию фермента в системе ЕО и выразим концентрацию его в любой момент времени как
[E] = [Eo] − [ES] . (6.3)
Подставив значение [E] в выражение (6.2), получим
k+1[Eo][S] − k+1[ES][S] − k−1[ES] − k+2[ES] = 0, (6.4)
откуда
k+1[Eo][S]
[ES] = -----------------------. (6.5)
k−1 + k+2 + k+1[S]
Числитель и знаменатель этого выражения разделим на k+1:
[Eo][S]
[ES] = ----------------------. (6.6)
(k−1+ k+2)/ k+1 + [S]
Обозначив
(k
получим следующее выражение для концентрации комплекса [ES]:
+ k+2)/ k+1 = Км, (6.7)
–1
[Eo][S]
[ES] = --------- . (6.8)
44
Км + [S]
Скорость образования конечного продукта v определяется скоростью распада фермент-субстратного комплекса:
v = k+2[ES]. (6.9)
Используя выражение (6.8), получим:
k+2 [Eo][S]
v = -----------------. (6.10)
Км + [S]
Максимальная скорость реакции V
достигается при такой
max
концентрации субстрата, когда весь фермент связан в фермент-субстратный комплекс, т. е.
[Eo] = [ES],
V
= k+2[ES] = k+2[Eo].
max
Тогда уравнение (6.10) можно выразить в виде
V
[S]
max
v = --------------. (6.11)
Км + [S]
Последнее выражение является основным уравнением стационарной кинетики ферментативных реакций и называется уравнением
Михаэлиса–Мэнтен, экспериментально доказавшими применимость
его ко многим ферментативным процессам. Соотношение констант
(6.7), обозначаемое Км, называется константой Михаэлиса–Мэнтен.
Она представляет собой такую концентрацию субстрата, при которой
скорость составляет половину максимальной. Км можно определить из
графика зависимости v от [S] (рис. 6.3). Она имеет размерность молярной концентрации.
Когда [S] приближается к Км, она начинает оказывать заметное
влияние на v. В этой области фермент работает со скоростью, равной
половине максимальной.
Практическое использование уравнения Михаэлиса–Мэнтен
можно проиллюстрировать на конкретных примерах.
45
1. [S] много меньше Км (точка А на рис. 6.3, 6.4).
В этом случае величину [S] в знаменателе можно опустить, и он
будет практически равен Км. Отношение двух констант V
и Км можно
max
заменить новой константой К:
V
[S]
max
v = ------------ = К[S].
К
м
Таким образом, когда концентрация субстрата значительно
ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, начальная скорость реакции v пропорциональна концентрации субстрата [S].
2. [S] много больше Км (точка С на рис. 6.3, 6.4).
В этом случае в знаменателе можно опустить член Км:
V
[S]
max
v = ------------ = V
max
.
[S]
Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного пре-
вышающей Км, начальная скорость v равна максимальной V
max
.
3. [S] = Км (точка В на рис. 6.3, 6.4), тогда
V
[S]
max
v = ------------ = V
max
/2.
[S]+ [S]
Следовательно, при концентрации субстрата, равной Км,
начальная скорость реакции v составляет половину максимальной. Отсюда же следует способ оценки Км. Следует экспериментально определить концентрацию субстрата, при которой начальная скорость равна
половине максимальной.
Для многих ферментов определение V
(соответственно и Км)
max
из графического выражения уравнения Михаэлиса–Мэнтен затруднено.
В этом случае используется уравнение, обратное указанному:
1/v = (Км + [S])/ V
max
[S].
46
Правую часть этого уравнения можно представить в виде
суммы двух слагаемых:
1/v = Км/ V
[S] + [S]/ V
max
max
[S]
или
Км/ V
[S] + 1/ V
max
max
.
В результате получаем уравнение прямой:
y = ax + b,
где
y = 1/v,
х = 1/[S].
Если построить график зависимости y (1/v ) от x (1/[S]), то длина
отрезка b, отсекаемого от оси y, будет равна 1/V
а равен Км/V
. Длину отрезка, отсекаемого от оси х (в области отрица-
max
, а тангенс угла наклона
max
тельных значений), можно получить, приняв y равным нулю. Тогда
х = −b/a = −1/ Км.
График уравнения Михаэлиса–Мэнтен в обратных координатах
называют графиком Лайнуивера–Бэрка (рис. 6.5).
Рис. 6.5. График Лайнуивера–Бэрка, используемый для графического
определения Км и V
max
.
47
С его помощью Км можно найти либо из наклона прямой
и длины отрезка, отсекаемого от оси y, либо из длины отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений от оси х. Поскольку [S] имеет
размерность молярной концентрации, Км также измеряется в молях на
литр. Скорость v может быть выражена в любых единицах, поскольку
Км не зависит от [E].
График, построенный в обратных координатах, позволяет определить Км по относительно небольшому числу точек, поэтому он достаточно часто используется.
Применяя на практике график Лайнуивера–Бэрка, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в том случае, когда измерения
проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [S], которые соответствуют равным интервалам по шкале обратных величин.
Альтернативный подход к экспериментальной оценке Км и V
max
предложили Иди и Хофсти. Они использовали преобразованное уравнение Михаэлиса–Мэнтен следующего вида:
vi /[S].= -v/ Км + V
max
/ Км.
Чтобы найти Км и V
от v (ось х). Тогда длина отрезка, отсекаемого от оси y, будет равна V
Км, а отрезка, отсекаемого от оси х, равна V
, строят график зависимости v/[ S] (ось y)
max
. Тангенс угла наклона
max
max
будет равен 1/ Км.
Уравнения Лайнуивера–Бэрка и Иди–Хофсти достаточно
удобны в ряде случаях, однако для строгого определения Км и V
max
тре-
буется соответствующая статистическая обработка.
Оценки Км имеют практическую ценность. При концентрациях
субстрата, в 100 раз превышающих Км, фермент работает почти с максимальной скоростью, поэтому величина V
будет отражать количе-
max
ство присутствующего активного фермента. Это обстоятельство используется при оценке содержания фермента в препарате. Значение Км
позволяет определить добавляемое количество субстрата при нахождении V
. Графики, построенные в обратных координатах, находят ши-
max
рокое применение при оценке действия ингибиторов.
По значению Км можно судить о сродстве фермента к субстрату,
которое определяется величиной, обратной константе диссоциации Кd
комплекса Е─S:
/
48
k+1
E + S ↔ E–S,
k
−1
К.d = k
−1
/ k+1.
Чем слабее выражена тенденция фермент-субстратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату. Мерой Кd может служить значение Км для данного фермента по отношению к его субстрату. Однако это возможно лишь в том случае, когда
справедливо допущение при выводе уравнения Михаэлиса–Мэнтен.
Оно состояло в том, что первая стадия ферментативной реакции идет
быстро, и поэтому всегда находится в состоянии равновесия. Иными
словами, скорость диссоциации комплекса E–S на Е и S намного выше,
чем скорость диссоциации на фермент и продукт:
k+2
E–S ↔ E + Р.
k
-2
Из уравнения Михаэлиса–Мэнтен следует, что величина [S],
при которой v= V
/2, равна
max
[S] = (k+2 + k−1)/ k1 = Км.
Но если k−1» k+2, то
k+2 + k-1 k−1,
[S] = k−1/ k1 Кd.
При этих условиях
1/ Км = 1/ К
d
и равно сродству фермента к субстрату. Если
k+2 + k
–1
k-1,
то 1/ Км даст заниженную оценку сродства.
49
Некоторые ферменты не подчиняются классической кинетике
насыщения Михаэлиса–Мэнтен. График зависимости v от [S] носит в
этом случае сигмоидный характер (рис. 6.6).
Рис. 6.6. Сигмоидная кинетическая кривая с насыщением
Такая форма кривой обычно указывает на кооперативное
связывание субстрата многими центрами. В таком случае описанный
выше метод графической оценки концентрации субстрата, при которой
скорость реакции составляет половину максимальной, оказывается
непригодным: прямой в соответствующих координатах уже не
получается. Здесь обращаются к графическому представлению
уравнения Хилла, первоначально предложенного для описания
связывания кислорода с гемоглобином. Вид преобразованного
уравнения Хилла для перевода графика в прямую:
log v/(V
− v) = n log [S] − log k’,
max
где k’ – константа.
Из уравнения следует, что в условиях, когда [S] мало по сравнению с k’, скорость реакции возрастает как n-я степень [S]. На рис. 6.7
приведен график Хилла, построенный по кинетическим данным для
фермента, характеризующегося кооперативным связыванием субстрата. График зависимости log {v/(V
– v)} от log [S] представляет
max
собой прямую с тангенсом угла наклона, равным n, где n – эмпирический параметр, зависящий от числа субстратсвязывающих центров и
характера взаимодействия между ними. При n=1 связывающие центры
не зависят друг от друга. При n1 между центрами имеется кооперативное взаимодействие, величина которого прямо пропорциональна n и
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]