Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
конформацией молекулы белка, делающей определенные пептидные
связи доступными для действия фермента.
7 . 1 . 1 . С е р и н о в ы е п р о т е и н а з ы ( 3 . 4 . 2 1 )
К группе сериновых протеиназ относятся ферменты животного,
растительного и микробного происхождения, многие из которых достаточно хорошо изучены и входят в состав промышленных ферментных
препаратов.
В поджелудочной железе человека и млекопитающих животных синтезируются такие сериновые протеиназы, как химотрипсины А
и В (КФ 3.4.21.1; химотрипсин С (КФ 3.4.21.2) и трипсин (КФ 3.4.21.4).
Трипсин (3.4.21.4). Трипсин – сериновая протеиназа, получен-
ная в кристаллической форме. Молекулярная масса около 23 800 Да.
Изоэлектрическая точка 10,6; оптимум действия находится между рН
7,0–9,0 для белков и синтетических субстратов. Выделяется поджелудочной железой в виде трипсиногена, активируется автокаталитически
при рН 7–9 или энтерокиназой, вырабатываемой слизистой оболочкой
тонких кишок. При этом от молекулы трипсиногена отщепляется
N-концевой гексапептид, реакция активируется кальцием.
Активная форма трипсина представляет собой однокомпонентный белок, состоящий из одной полипептидной цепи, с молекулярной
массой 22,9–25,5 кДа и оптимальным рН 7–8. Он стабилен при рН не
выше 6, а в щелочной среде подвержен автолизу, т. е. самопереваривается. В организме трипсин стабилизируется с помощью ингибитора
в неактивный, устойчивый к протеолизу комплекс.
Трипсин не является ферментом первичного действия, т. е.
или совсем не расщепляет нативные белки, или действует на них
слабо и медленно. Белки, денатурированные нагреванием, обработанные кислотами, солями, щелочами и пепсином, легко подвергаются действию трипсина.
Трипсин гидролизует пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит основным аминокислотам – лизину или аргинину (рис. 7.2)
61
Рис. 7.2. Аминокислоты, карбоксильные связи которых
гидролизует трипсин
При замещении аминной группы в боковой цепи действие трипсина прекращается. Продуктами действия трипсина являются полипептиды и аминокислоты. Фермент гидролизует также сложноэфирные
и лактонные связи.
Высокоочищенный трипсин применяется для медицинских целей. Это одна из главных протеаз поджелудочной железы, которая
в виде неочищенного панкреатина находит применение при мягчении
голья в кожевенном производстве.
Химотрипсин (КФ 3.4.21.1). Химотрипсин – протеолитический
фермент, секретируемый поджелудочной железой в тонкий кишечник
в виде неактивного предшественника, называемого химотрипсиногеном. Химотрипсиноген представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 245 аминокислотных остатков и содержащую пять дисульфидных связей. Он активируется в тонком кишечнике под действием
трипсина. При этом происходит гидролиз четырех пептидных связей и
отщепление двух дипептидов (14–15 и 147–148). В результате образуется активный химотрипсин, состоящий из трех полипептидных цепей,
ковалентно связанных двумя дисульфидными мостиками.
Для проведения каталитического акта необходимо взаимодействие аминокислотных остатков гистидина, аспаргиновой кислоты
и серина, находящихся в разных полипептидных цепях. Однако в третичной структуре молекулы фермента они оказываются очень близко
друг к другу, образуя своеобразный карман на поверхности молекулы,
куда проникает субстрат и где протекает каталитическая реакция.
Молекулярная масса около 22,5 кДа. Изоэлектрическая точка
8,3; оптимум рН в пределах 7,0–9,0, что согласуется с естественными
условиями его действия. Специфичность химотрипсина заключается
в том, что он предпочтительнее гидролизует пептидные связи,
62
образованные ароматическими аминокислотами: тирозином, триптофаном, фенилаланином.
Химотрипсины, как и трипсин, расщепляют сложные эфиры
и лактоны (внутренние циклические сложные эфиры, содержащие
группировку –COO– в кольце). Разнообразие типов гидролизуемых
связей определяет широкую специфичность действия этих ферментов. Химотрипсин является составной частью комплексных препаратов панкреатина.
К семейству химотрипсина, помимо его разновидностей и трипсина, относятся также и другие сериновые протеиназы животного происхождения – эластаза, тромбин, плазмин, тканевые сериновые протеиназы.
Эластаза (панкреатопептидаза) вырабатывается поджелудочной железой и способна гидролизовать эластиновые волокна.
Молекулярная массы эластазы около 25 кДа, изоэлектрическая
точка – 9,5. Фермент отличается высокой термолабильностью, наиболее устойчив при рН 6,0–8,5; стабилизируется ионами кальция. Эластаза осуществляет гидролитическое расщепление пептидной связи,
образованной нейтральными аминокислотами с ароматическими цепочками (лейцин, валин). Существует мнение, что при действии эластазы на эластиновые волокна последние деполимеризуются и превращаются в глобулы.
Эластаза способна освобождать эластин от связанных с ним полисахаридов и липидов. Ингибируется фермент ионами меди, хлористого натрия и калия, сульфатом аммония. Активируется трипсином.
В группу сериновых входят многие внеклеточные и внутриклеточные протеиназы микроорганизмов. Классическими представителями секретируемых протеиназ бактерий являются субтилизины из
культуры В. Subtilis. Они представляют собой ферменты с молекулярной массой 26,3–27,5 кДа с оптимумом действия при рН 8–11. Внутриклеточные сериновые протеиназы по отношению к животным белкам
малоактивны.
Актиномицеты, представляют собой бактерии, имеющие способность к формированию на некоторых стадиях развития ветвящегося
мицелия. Ряд исследователей, подчеркивая бактериальную природу актиномицетов, называют их аналог грибного мицелия «тонкими нитями». Сериновые протеиназы актиномицета Str. griseus входят в состав ферментного препарата Проназы. Проназа является комплексным
препаратом, состоящим из четырех нейтральных, трех щелочных протеиназ и трех-пяти аминопептидаз и карбоксипептидаз.
63
Это стабильный ферментный препарат, обладающий широкой специфичностью и способностью глубоко (на 70–90 %) гидролизовать субстрат до аминокислот.
Многие виды микроскопических грибов синтезируют внеклеточные сериновые протеиназы. Большинство исследованных ферментов этой группы имеют молекулярную массу 18–35 кДа, оптимум действия при рН от 5 до 12 и температуре 55–60 °С. Многие сериновые
протеиназы грибов стабилизируются ионами кальция. Они в основном
проявляют эстеразную активность, но некоторые способны расщеплять
коллаген и эластин.
Сериновые протеиназы входят в состав комплексных ферментных препаратов, выделяемых из грибов аспергиллов.
В соке многих растений присутствуют также растворимые
формы субтилизиноподобных сериновых протеиназ. Их выделили из
плодов дыни, тыквы, томатов, из листьев подсолнечника, корней одуванчика, плодов маклюры (сем. тутовых). Все исследованные растительные субтилизины – гликопротеины. Например, фермент из маклюры содержит до 25 % углеводов. Растительные протеиназы имеют
широкую зону рН стабильности. Они гидролизуют белки, преимущественно расщепляя связи, образованные гидрофобными аминокислотами, с меньшей скоростью – образованные цистеином, дикарбоновыми аминокислотами и их амидами.
Сериновые протеиназы животного и микробного происхождения прочно вошли в номенклатуру промышленных ферментных препаратов. Из животного сырья производят трипсин, химотрипсин и комплексный препарат с активностью обоих этих ферментов. Из микробного сырья получают Проназу, Римопротелин, Протосубтилин щелочной, Амилопроторизин, Лизосубтилин и др.
Многие гидролитические ферментные препараты содержат
внутриклеточные сериновые протеиназы в качестве сопутствующих
ферментов. Присутствие щелочных сериновых протеиназ в неочищенных ферментных препаратах может приводить к потере активности различных ферментов за счет протеолитической инактивации. В препаратах других белков сериновые протеиназы могут долго сохранять активность, будучи защищенными субстратами.
64
7 . 1 . 2 . Т и о л о в ы е ( ц и с т е и н о в ы е ) п р о т е и н а з ы
( 3 . 4 . 2 2 )
В эту группу входят эндопептидазы, для проявления каталитической активности которых необходима сульфгидрильная группа цистеина. Тиоловые протеиназы ингибируются окислителями (например,
монойодуксусной кислотой) и ионами тяжелых металлов, активируются восстановителями (например, бисульфитом натрия, цистеином).
Большинство тиоловых протеиназ имеют оптимальный рН в слабокислой или нейтральной среде.
Катепсин (3.4.22.1). Ферменты класса гидролаз, катализирую-
щие гидролиз пептидной связи и известные как катепсины (от греч.
kathepso – перевариваю), содержатся в тканях животных и человека.
По строению активного центра различают три группы катепсинов: сериновые, карбоксильные и самые многочисленные тиоловые. Катепсины этой группы имеют молекулярную массу от 25 до 35 кДа и катализируют наряду с гидролизом пептидов гидролиз амидов аминокислот. Катепсин, занимающий первую позицию в 22 подгруппе, является
наиболее распространенным. Этот фермент находится в виде катепсиногена во всех животных тканях. В наибольших количествах содержится в печени, селезенке и почках. Вместе с ним присутствует естественный активатор зоокиназа, который можно отделить от катепсина.
Катепсин действует на соединения, содержащие ароматическую аминокислоту, и расщепляет пептиды с N-конца пептидной связи. Обычно
катепсин катализирует гидролиз белков при автолизе. В нейтральной
среде он неактивен, оптимальный рН действия 4–5. Катепсин активируется различными восстановителями, что сводится к расщеплению
в нем S-S-связей и превращению их в группы -SH.
После смерти животного в тканях, в том числе в кожевенном и
меховом сырье, накапливаются молочная и другие кислоты, т. е. образуется кислая среда. В результате этого катепсин приобретает способность каталитического действия на гидролиз тканевых белков. Это
нужно учитывать при первичной обработке сырья, в частности необходимо его своевременно консервировать.
Среди тиоловых протеиназ растительного происхождения
наиболее часто используются папаин (КФ 3.4.22.2) и химопапаины: А и
В (КФ 3.4.22.6), выделяемые из млечного сока дынного дерева.
Это ферменты молекулярной массы 23,4–28 кДа с оптимумом рН 6–7 и
65
широкой зоной стабильности. Например, папаин стабилен в интервале
от 3 до 11 рН. Однако в присутствии окислителей активность быстро
теряется, поэтому при работе с ним необходимо следить за окислительным потенциалом среды.
Бромелаин (КФ 3.4.22.4) выделяют из сока зрелых стеблей ананаса. Фермент имеет молекулярную массу 35 кДа и оптимальный рН 5–6.
Фицин (КФ 3.4.22.3) получают из латекса тропического инжира;
молекулярная масса 23,8 кДа и оптимальный рН 6,5–9.
Папаин, бромелаин и фицин – протеиназы широкой субстратной специфичности. Они гидролизуют в белках пептидные связи, образованные лейцином или глицином. Другие типы связей, характерные
для специфичности пепсина, трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, также могут расщепляться, хотя и с меньшей скоростью. Благодаря этому растительные тиоловые протеиназы более глубоко гидролизуют белки, чем сериновые и карбоксильные протеиназы животного
происхождения.
Тиоловые протеиназы продуцируются также бактериями, реже грибами. Микробные тиоловые протеиназы наиболее активны при рН 7–8,8.
7 . 1 . 3 . К а р б о к с и л ь н ы е п р о т е и н а з ы ( 3 . 4 . 2 3 )
Они распространены у животных и эукариотических микроорганизмов и в каталитическом центре имеют две карбоксильные группы.
Активность карбоксильных протеиназ подавляют эпоксисоединения,
диазокетоны и природные ингибиторы, например пептиды типа пепстатина. Их также называют кислыми протеиназами, поскольку за редким
исключением они проявляют активность в кислой среде. К числу кислых протеиназ относятся пепсины млекопитающих – пепсин А
(КФ 3.4.23.1), пепсин В (КФ 3.4.23.2) и пепсин С (КФ 3.4.23.3) с молекулярной массой 31–40 кДа и оптимумом действия при рН 2–4.
Пепсин (3.4.23.1). Фермент желудочного сока, выделяемый
клетками слизистой оболочки желудка в виде неактивного пепсиногена
с молекулярной массой 42 кДА, активируется в присутствии соляной
кислоты или автокаталитически гидролизом активным пепсином, превращаясь в пепсин (34–35 кДа). Один из пептидов, отщепляемых от
пепсиногена, является ингибитором активного фермента. Ингибитор
66
имеет молекулярную массу 3,2 кДа, он соединяется с пепсином при рН
не ниже 5. В кислой среде при рН 2 происходит самопереваривание
фермента, что защищает слизистую оболочку желудка от разрушения.
Пепсин является ферментом первичного воздействия, т. е. расщепляет почти все нативные белки, гидролизуя при продолжительном
действии около 30 % пептидных связей, однако действует медленнее,
чем другие протеиназы. Пепсин проявляет специфичность: гидролизует связи аминокислот, содержащих ароматические кольца в боковой
цепи и свободные карбоксильные группы. Наличие свободной аминогруппы вблизи пептидной связи препятствует гидролизу белка.
Пепсин слабо действует на кератин, протамины и продукты
гидролиза белков с низкой молекулярной массой. Он широко применяется для обработки и утилизации коллагенсодержащих отходов с целью
их дальнейшего растворения.
Способность синтезировать кислые протеиназы широко распространена у микроскопических грибов – аспергиллов, пенициллов,
мукоров. Внеклеточные кислые протеиназы грибов – ферменты молекулярной массы от 30 до 100 кДа (чаще 32–39 кДа), с оптимумом действия при рН 2–4,6. Стабильны до рН 6, в нейтральной среде быстро и
необратимо инактивируются. Оптимальная температура действия
55–75 °С. По специфичности действия кислые протеиназы грибов
сходны с пепсином. Они расщепляют пептидные связи, образованные
ароматическими и другими гидрофобными аминокислотами с объемными боковыми цепями.
Внеклеточные кислые протеиназы грибов, наряду с другими видами протеолитических ферментов, входят в состав комплексных ферментных препаратов, таких как Амилоризин, Амилопроторизин, Пектавоморин, Пектафоетидин.
7 . 1 . 4 . М е т а л л о с о д е р ж а щ и е п р о т е и н а з ы
( 3 . 4 . 2 4 )
Коллагеназа (3.4.24.3). Это высокоспецифический фермент,
расщепляющий в щелочной среде нативный коллаген на пептиды без
образования аминокислот. Другие белки не расщепляет. Коллагеназа
67
действует на коллаген сильнее, чем на синтетические пептиды, построенные по типу коллагена.
Коллагеназа может быть выделена из измельченной поджелудочной железы путем экстракции 20 % водным раствором глицерина
при 20 °С в течение 24 ч. Очищенная коллагеназа имеет молекулярную
массу 109 кДа, ее изоэлектрическая точка около 8.6.
Коллагеназа очень чувствительна к изменениям рН и температуры. Она устойчива только при 4 °С и рН 6,5–7,8. При снижении
рН до 4 активность коллагеназы снижается наполовину. При повышении температуры до 18–20 °С активность коллагеназы полностью исчезает через сутки. При нагревании в течение 30 мин при 50 °С фермент
полностью теряет свою активность.
Ионы кальция при концентрации до 1 М активируют коллагеназу, а при более высоких концентрациях снижают ее активность. Ионы
магния, кобальта, марганца являются ингибиторами коллагеназы.
7 .2. Э с т е р а з ы ( К Ф 3 . 1 )
Эстеразы относятся к подклассу 3.1 и катализируют обратимую
реакцию гидролиза и синтеза сложных эфиров.
Этот подкласс включает большое число ферментов (около 150),
которые разделены на семь подподклассов: ферменты, действующие на
эфиры карбоновых кислот (3.1.1); эстеразы тиоловых эфиров (3.1.2);
гидролазы фосфорных моноэфиров или фосфатазы (3.1.3); гидролазы
фосфорных диэфиров (3.1.4); гидролазы моноэфиров олигофосфорных
кислот (3.1.5); сульфатазы (3.1.6); эстеразы моноэфиров дифосфорных
кислот (3.1.7).
Наиболее важными с точки зрения участия в различных биохимических процессах, имеющих место при хранении и переработке кожевенного и мехового сырья, являются ферменты подподкласса 3.1.1.
Липаза (КФ 3.1.1.3). Липаза, или триацилглицероллипаза, ши-
роко распространена в природе. В настоящее время выделены и охарактеризованы липазы растительного происхождения (липаза клещевины,
пшеницы и других злаков), животного (панкреатическая липаза, липаза
молока) и микробного (бактериальные и грибные липазы).
68
Установлено, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолекулярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты. Ферментативный гидролиз липидов имеет существенное отличие от других
гидролитических реакций. Парадокс заключается в том, что липаза –
водорастворимый фермент, а ее субстрат гидрофобен, однако активность липазы возрастает на границе «вода – липид». Этот феномен известен под названием «межфазная активация».
Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от
друга по специфичности действия, сродству к различным субстратам,
растворимости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например, липаза
семян клещевины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7–5,0; панкреатическая липаза растворима, а оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной среде. Липазы микробного происхождения и липаза пшеничных зародышей также отличаются от липазы клещевины. Они растворимы в воде и имеют рН оптимум при 8,0. Липаза молока, молекулярная масса которой примерно 7000 Да, имеет оптимум рН 9,0–9,2 при гидролизе молочного жира. В технологии кожи и меха широко применяется
для обезжиривания волосяного покрова мехового сырья.
7 . 3 . Г л и к о з и д а з ы ( 3 . 2 . 1 )
Гликозидазы, или гидролазы гликозидов, относятся к группе
3.2, подгруппе 3.2.1 и катализируют гидролиз и синтез дисахаридов
(мальтозы, сахарозы, лактозы) и полисахаридов (крахмала, декстрина,
гликогена).
R-O-R’ + H2O = R-OH + R`-OH,
где R и R’ остатки моносахаридов.
Этот подкласс включает около ста ферментов с разной специфичностью действия, некоторые ферменты этого типа способны осуществлять трансферазные реакции – переносить гликозидные остатки
на олиго- и полисахариды, наращивать полисахаридные цепочки. Представители гликозидаз были одними из первых ферментов, обратимость
действия которых in vitro (вне организма) была экспериментально доказана.
69
К гликозидазам относятся ферменты мальтаза (-глюкозидаза),
сахараза, лактаза, катализирующие распад дисахаридов и различные
амилазы (амилолитические ферменты), катализирующие распад полисахаридов.
Фермент мальтаза присутствует в солоде, дрожжах, плесневых
грибах и тонких кишках, обычно вместе с амилазой. Он расщепляет
-глюкозидные связи, разлагая мальтозу на две молекулы -глюкозы.
Амилазы распространены почти во всех растениях, животных
и микроорганизмах. К группе амилолитических ферментов относятся
α- и -амилазы, глюкоамилаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы, как и пептидазы, делятся на эндо- и экзоамилазы.
Четко выраженной эндоамилазой является α-амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата. Глюкоамилаза и -амилаза являются экзоамилазами, т. е. атакующими субстрат по концевым звеньям.
α-Амилаза (КФ 3.2.1.1). α-Амилазы обнаружены у животных
(в слюне и поджелудочной железе), в растениях (проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются плесневыми грибами и бактериями. Все эти ферменты гидролизуют крахмал, гликоген и родственные α-1,4-глюканы с образованием, главным образом декстринов
и небольшого количества дисахарида – мальтозы.
α-Амилаза – водорастворимый белок, обладающий свойствами
глобулина. Он назван так, потому что образующиеся продукты гидролиза, имеют -мутамерную форму.
Характерной особенностью всех α-амилаз является наличие одного атома Са на молекулу фермента. Роль кальция состоит в том, что
он стабилизирует вторичную и третичную структуры молекулы α-амилазы, обеспечивая таким образом ее каталитическую активность и вместе с тем предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов и тепловой денатурации. Полное удаление кальция приводит
к инактивации фермента, повторное введение – частично восстанавливает активность.
Различные α-амилазы отличаются по молекулярной массе,
устойчивости к нагреванию и некоторым другим показателям. Молекулярная масса α-амилаз близка к 50 кДа, за исключением некоторых бактериальных α-амилаз. Например, B. macerans имеет молекулярную
массу 130 кДа, а широко применяемая в промышленности α-амилаза из
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]