Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
растворах нейтральных солей и слабощелочных, второй – в слабых
кислотах. Содержание проколлагена в шкурах молодых животных может доходить до 11 %, но с возрастом оно снижается до 1 %. Из соответствующих растворов эти растворимые формы коллагена могут
быть высажены. Этот процесс называется реконституцией. Объяснить
различные формы существования коллагена можно следующим образом. Стабилизация структуры и нерастворимость коллагена обусловлены внутри- и межмолекулярным поперечным сшиванием как между
отдельными спиралями внутри трехцепной спирали, так и между
трехспиральными частицами. В зрелом коллагене, в отличие от его
предшественников, кроме физических связей (водородных, электровалентных и гидрофобного взаимодействия), структура скрепляется
несколькими прочными химическими ковалентными поперечными
связями (амидными).
В стабилизации надмолекулярной (четвертичной) структуры
коллагена участвуют и углеводные компоненты, образованные в результате гликозилирования гидроксилизиловых остатков. Их удаление,
например при действии ферментов, приводит к разделению структурных элементов и расщеплению коллагена.
Под расщеплением следует понимать совокупность процессов
разделения коллагена на структурные элементы с разрушением в нем
различных видов связей. Можно выделить продольное расщепление,
или разрыхление, т. е. разрыв поперечных связей, характеризующийся
выплавляемостью, и поперечное расщепление, или деполимеризацию,
т. е. разрыв связей в главных цепях, характеризующийся распадом или
растворимостью. Основным желательным результатом расщепления
является достижение определенной степени разрыхления, а не деполимеризация. Процессы разделения надмолекулярной структуры дермы и
расщепления коллагена, происходящие под химическими, ферментативными или механическими воздействиями тесно связаны с качеством
получаемого полуфабриката и определяют его свойства.
Наибольший интерес для кожевенного и мехового производства представляет действие протеиназ. По воздействию на коллаген
протеиназы можно разделить на неспецифические (трипсин, пепсин,
щелочная и кислая протеиназа) и специфические (коллагеназа).
Действие трипсина на коллаген. Трипсин действует на пептидные связи в главных цепях коллагена и не действует на межмолекулярные. Кроме того, для действия трипсина необходимо наличие свободных амино- и имино-групп. Поэтому нативный коллаген с высоким
101
содержанием поперечных ковалентных связей и практическим отсутствием аминогрупп в боковых цепях устойчив к действию трипсина.
Измененный коллаген после предварительных обработок, при которых
происходят расщепление коллагена и разрыв поперечных ковалентных
связей, подвергается действию трипсина. Механизм действия трипсина
заключается в присоединении его с одной стороны к свободным аминогруппам коллагена (прежде всего, боковых цепей), наиболее близкорасположенным к пептидным связям, с другой – к NH-группам пептидных связей и образующимся при их расщеплении НО-группам с последующим каталитическим воздействием на гидролиз этих связей. Таким
образом, происходит деструкция главных цепей коллагена.
Предварительные обработки, приводящие к образованию в коллагене новых поперечных связей (сухое нагревание, формалинование,
дубление), придают ему устойчивость к действию трипсина.
Оптимальные условия действия трипсина на коллаген:
рН – 8–8,2 и температура 37 °С.
Действие пепсина на коллаген. Пепсин в отличие от трипсина
действует на неизмененный коллаген. Он гидролизует пептидные связи
между цепями коллагена и частично в главных цепях. Механизм действия заключается в присоединении пепсина к свободным карбоксильным группам коллагена и одной из групп тех связей между цепями или
пептидных связей в главных цепях, гидролиз которых он катализирует.
Полному распаду коллагена под действием пепсина способствует двухстадийная обработка. На первой стадии коллаген сильно набухает и в
раствор переходит около 10 % белка. На второй стадии после обработки в свежем подкисленном растворе пепсина достигается полная
растворимость коллагена. Оптимальные условия действия пепсина:
рН – 1,65–2 и температура 37 °С.
Зрелый нерастворимый коллаген после обработки протеиназами становится кислоторастворимым и только по некоторым свойствам отличается от проколлагена.
Субтилизины гидролизуют связи как в главных цепях, так и в
поперечных – внутри- и межмолекулярных, отщепляя свободные аминокислоты. С наибольшей скоростью субтилизины действуют на связи,
образованные карбоксильными группами аминокислот с гидрофобными боковыми радикалами.
Наиболее активными протеолитическими ферментами являются нейтральные протеиназы. Они расщепляют в коллагене связи,
102
образованные аминными группами аминокислот с гидрофобными боковыми радикалами.
Существуют комплексные ферментные препараты, обладающие высокой протеолитиеской активностью и состоящие из нескольких
пептидаз и протеиназ. К таким препаратам относятся Проназа, Протелин и Римопротелин. Так, число распавшихся пептидных связей на
1 моль белка составляет для Протелина – 20,5; для Римопротелина –
17,8; для трипсина – 3,2.
1 1 . 3 . С т р о е н и е и с т р у к т у р а к е р а т и н а
Кератины (от греч. kéras, род. падеж kératos – рог) – фибриллярные белки, волокна которых входят в состав рогового слоя кожи, волос,
шерсти, перьев, чешуи, ногтей, рогов, клюва, копыт. Они нерастворимы в воде и органических растворителях, устойчивы к действию протеолитических ферментов. Методом рентгеноструктурного анализа
установлено, что полипептидные цепи кератинов могут быть в скрученной и растянутой форме. Структура нерастянутых волокон (так называемая ά-структура) характерна для кератина млекопитающих; у пресмыкающихся и птиц (например, в перьях) встречается также растянутая форма кератина (β-структура). Для первичной структуры α-кератинов характерно большое содержание цистеина и множество дисульфидных связей. Нерастворимость кератина и обусловлена наличием между
полипептидными цепями поперечных дисульфидных связей. Поэтому
кератин часто называют вулканизированным белком.
Молекулярная масса – от 10 до 50 кДа. Периодичность в чередовании аминокислотных остатков в молекулах отсутствует.
Вторичная структура кератина состоит из α-спирали, 3 спирали
образуют систему, закрученную в спираль, которая называется прото-
фибриллой. Внутри волоса протофибриллы образуют микрофибриллы.
Ранее считалось, что центральная пара протофибрилл окружена девятью протофибриллами. Таким образом, каждая микрофибрилла содержит 11 протофибрилл.
В настоящее время большая часть ученых склоняется к тому, что
основным структурным элементом α-кератина являются цилиндрические
103
микрофибриллы (диаметр 75 А), состоящие из спирализованных, скрученных попарно протофибрилл (рис. 11.8).
Рис. 11.8. Вероятная структура кератина
Кератины млекопитающих различаются главным образом по
аминокислотному составу и по способу упаковки микрофибрилл,
а также по количеству матрикса – белка с высоким содержанием серы,
в который они погружены. Расположенные пучками параллельно оси
волоса шерсти микрофибриллы сцементированы матриксом в макрофибриллы. Агрегация макрофибрилл образует кортикальные клетки.
11.4 . С в о й с т в а к е р а т и н а
В волосе различают три основных слоя: кутикулу, корковый
слой (кортекс) и сердцевину. Каждый из них образован кератином с
различным содержанием серы.
Волос является плохим проводником электрического тока и обладает трибоэлектрическими свойствами, т. е. при трении способен
накапливать на поверхности статические заряды. Волокна шерсти обладают фрикционными свойствами, способностью к свойлачиванию. Они
могут сильно растягиваться под действием силы. При этом относительное удлинение может достигать 100 %. После прекращения нагрузки
первоначальная длина может полностью восстановиться.
104
На механические свойства кератина оказывает большое влияние количество межмолекулярных связей. Прочность сухих волокон шерсти
больше, чем мокрых, это объясняется ослаблением водородных и электровалентных связей при набухании кератина в воде. Под действием некоторых химических веществ межмолекулярные дисульфидные связи
кератина разрушаются, и волос может сократиться до 2/3 первоначальной своей длины. Это явление называется сверхсокращением или супер-
контракцией. Вызывают сверхсокращение такие вещества, как тетраоксидисульфаты, сульфокислоты, хлорамиды. Растворы сульфата натрия и
пероксид хлора, разрушая дисульфидные связи, не вызывают сверхсокращения. Такие соединения, как фенолы и формамид, дисульфидные
связи не разрушают, но тем не менее способствуют сверхсокращению,
которое связано с разрывом водородных связей. Существует некоторая
аналогия между процессами сваривания коллагена и сверхсокращением
кератина. Различие состоит в необходимости предварительного растяжения кератина и более высокой температуры для сверхсокращения, что
связано с большой прочностью структуры кератина. Сами волокна шерсти обладают гидрофильностью, т. е. сродством к воде. Водоотталкивающие свойства зависят от природы поверхности волоса, а гидратация и
набухание кератина происходят внутри волокон. При насыщении волокна водой его диаметр увеличивается до 17–18 %, а длина – до
1,2–1,8 %. Это объясняется волокнистой структурой кератина. При действии воды на сухой кератин (как и в случае с коллагеном) в начале происходят процессы химического связывания воды и гидратация, а затем
набухание. Гидратационной воды в кератине содержится до 5 %. Воды
набухания – от 30 до 60 %.
Нагревание кератина до высоких температур в присутствии
воды приводит к сверхсокращению.
Кератин более устойчив к сухому нагреву, до температуры
120 °С его основные физические и химические свойства практически
не меняются. При длительном нагревании свыше 100 °С может проходить дополнительное структурирование кератина за счет образования
поперечных амидных связей. Термическая деформация кератина начинается после 160 °С и проявляется в снижении прочности и удлинении
при разрыве.
Процесс термической деформации проходит через несколько
стадий:
1) до температуры 105 °С происходит удаление основного ко-
личества воды набухания;
105
2) при дальнейшем повышении температуры начинаются уда-
ление гидратной воды и конформационные изменения молекул;
3) резкое уменьшение длины (сверхсокращение), начинающе-
еся при температуре 216 °С;
4) резкое увеличение длины образца (начало текучести), связан-
ное с началом термической деструкции белка, температура 229 °С.
Кератин более устойчив к действию кислот, чем щелочей.
Дисульфидная связь даже при продолжительном кипячении в растворах сильных минеральных кислот не разрушается. Однако под
действием ряда факторов дисульфидная связь может превращаться в
лантиониновую:
R – CH2 – S – S – CH2 – R' → R – CH2 – S – CH2 – R'.
Этот процесс называется цистинлантиониновой трансформацией. Лантиониновые связи придают кератину большую химическую
стойкость.
Волокна шерсти полностью гидролизуются только 10 Н раствором соляной кислоты после 4 ч кипячения. При действии же 0,1 Н раствора при температуре 65 °С уже через 1 ч растворяется до 10 % волокон шерсти.
11.5. Д е й с т в и е ф е р м е н т о в н а к е р а т и н
Аминокислотный состав кератина характеризуется значительным содержанием цистина и серы. Боковые цепи аминокислот, составляющих кератин, имеют карбоксильные, аминные и окси-группы (за исключением оксипролина). Особенностью кератина является то, что его
молекулярные цепи соединены, кроме межмолекулярных связей, присущих коллагену, короткими поперечными дисульфидными -S-S-. Дисульфидная связь, прочно соединяющая цепи, придает кератину устойчивость к воздействию кислот и солей. Однако она очень легко гидролизуется в присутствии щелочей, восстанавливается и окисляется.
К действию ферментов кератин обладает большой устойчивостью, которая ослабляется после восстановления дисульфидных связей.
Кератин разрушается при поражении его гусеницами моли,
106
пищеварительные соки которых имеют рН 9,9 и содержат вещество, способное восстанавливать дисульфидные связи. Последнее обстоятельство
необходимо для действия протеолитических ферментов. Т. е. растворение кератина обусловливается не присутствием в составе пищеварительных соков гусениц специальных ферментов, а присущим им восстановительным действием, в результате которого возможно дальнейшее повреждение кератина обычными протеолитическими ферментами.
Существует фермент кератиназа, который способен гидролизовать нативный кератин в отсутствие восстанавливающих веществ. Кератиназа переводит в растворимое состояние до 1/3 нативных белков
шерсти. Оптимум действия – рН=9, основные продукты гидролиза –
пептиды.
11.6. Э л а с т и н
Эластин – основная составная часть эластиновых волокон, которые образуют сетку в верхнем и нижнем слоях дермы. Как правило,
на долю эластина приходится не более 1 % от массы коллагена шкуры.
Однако в дерме, например, морского котика это содержание значительно выше.
То, что гистологи называют эластиновыми волокнами, представляет по существу многокомпонентную систему. Ее структурная организация представлена на рис. 11.9. Одним из компонентов являются
тонкие, прямые, легко окрашиваемые фибриллы толщиной 11–12 нм.
По составу это гликопротеины, участвующие в образовании волокон
эластина и влияющие на их размер и пространственную организацию.
Гибкость эластина связана со свойствами его субъединиц (названных
после их выделения -эластином). На электронно-микроскопическом
изображении они представлены глобулами диаметром около 3 нм.
Их молекулярная масса составляет 74 кДа.
Известен аминокислотный состав -эластина, в котором преобладают глицин, аланин, валин и пролин, составляющие до 70 % всех
аминокислотных остатков. Цистеин в эластине отсутствует.
Из-за малого содержания кислых и основных аминокислот
молекула мономерного эластина практически неполярна.
107
Изоэлектрическая точка смещена в слабокислую область, поскольку
существует некоторое преобладание кислых групп.
Рис. 11.9. Структурная организация эластина
В водной среде цепи эластина принимают форму глобул. При
этом гидрофобные цепи неполярных аминокислот, образующие множество гидрофобных связей, спрятаны внутри молекулы, окруженной водой. В результате свободная энергия такой системы минимальна.
Некоторые субъединицы эластина связаны в сетчатую структуру с помощью соединений, называемых десмозинами (десмозин
и изодесмозин). Это гетероциклические соединения, образованные при
окислении лизиновых остатков мономерного эластина до
-полуальдегида аминоадипиновой кислоты (аллизин). В результате
его циклизации с участием нескольких нестабильных промежуточных
108
соединений образуются гетероциклы с характерным максимумом поглощения при 275 нм. Молекулы десмозинов составляют около 1 %
аминокислот и образуют прочные связи между протомерами эластина
(рис. 11.10). Для поддержания гибкости структуры эти связи должны
находиться на значительном расстоянии друг от друга.
Волокна эластина могут растягиваться в два и более раза и сохраняют высокую прочность на разрыв даже в полностью растянутом состоянии. Их сокращение происходит самопроизвольно, т. е. после снятия
нагрузки длина волокон восстанавливается до первоначальной величины.
Высокоэластичные свойства нерастворимого полимерного эластина объясняются структурным расположением мономеров. При растяжении нарушаются гидрофобные взаимодействия и изменяется расположение молекул воды. После снятия нагрузки самопроизвольно
восстанавливается исходное состояние (рис. 11.20).
Рис. 11.10. Деформация эластина
Эластин представляет собой гликопротеин с молекулярной
массой 70 кД, который содержит много гидрофобных аминокислот.
В отличие от большинства белков, пептидные цепи эластина не
приобретают характерную третичную структуру, а сохраняют гибкую
структурную конформацию.
109
Эластин менее устойчив к действию трипсина, чем коллаген. Пепсин на эластин не действует. Ферментом, специфически действующим на
эластин, является эластаза, выделенная из поджелудочной железы.
Вопросы и задания
1. Какими химическими соединениями преимущественно пред-
ставлен состав кожи?
2. Какова характерная особенность альбуминов? Какими свой-
ствами они обладают?
3. Какие белки входят в состав межволоконного вещества?
4. Какими предполагаемыми функциями обладают олигосаха-
ридные (гликановые цепи), входящие в состав гликопротеинов?
5. Какие вещества являются доминирующим компонентом
межклеточного матрикса и выполняют функцию межволоконного
наполнителя?
6. На какие три группы обычно подразделяют белки соединительных тканей?
7. Какие вещества исполняют роль основного скрепляющего
компонента, наличие большого количества каких групп это обеспечивает, одним из представителей которых является гиалуроновая кислота?
8. Что из себя представляют хондротинсульфаты?
9. Опишите механизм действия гилуронидазы.
10. Какие вещества входят в число субстратов β-глюкуронидазы?
11. Схематически изобразите строение протеогликанового агрегата.
12. Схематически изобразите основные компоненты живой кожи.
13. Чем в основном представлены коллагеновые волкна дермы?
14. Какой подход используется для классификации сложных
белков?
15. Какой фибрилярный белок считается основным структурным компонентом межклеточного матрикса?
16. Чем определяется наиболее характерная особенность коллагена?
17. Какая аминокислота может поместиться под цунтральным
ядром тройной спирали молекулы коллагена?
18. Какие аминокислоты ограничивают вращение полипептидного стержня коллагена, тем самым увеличивая его стабильность?
19. Схематически представьте внутриклеточные стадии синтеза
коллагена.
20. Опишите внеклеточные стадии образования коллагена.
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]