Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
Рис. 11.3. Схематическое изображение протеогликанового агрегата
Гидролиз полисахаридных цепей осуществляется эндогликозидазами, экзогликозидазами и сульфатазами. Каждая из этих групп ферментов обладает субстратной специфичностью.
Гиалуронидаза – широко распространенная эндогликозидаза, расщепляющая гликозаминные связи. Гиалуронидаза действует и на гиалуроновую кислоту, и на хондроитинсульфат с образованием тетрасахарида. Последний может подвергаться дальнейшему гидролизу под действием -глюкуронидазы и -N-ацетилгекзосаминидазы. Нейтральные гексозамингликаны (состоящие из
аминосахаров и гексоз) связаны с белками более прочно и гиалуронидазой не гидролизуются.
-Глюкуронидаза представляет собой экзогликозидазу, удаляю-
щую остатки D-глюкуроновой и L-идуроновой кислот с концов тетрасахаридов или полисахаридов большего размера. В число субстратов -
глюкуронидазы входят дерматансульфат, гепарансульфат, хондроитинсульфат и гиалуроновая кислота.
Таким образом, все белково-углеводистые комплексы шкуры
могут расщепляться под действием специфических ферментов.
Протеолитические ферменты действуют на их белковую
составляющую, а углеводная часть расщепляется гликозидазными ферментами. Удаление межволоконного вещества способствует
91
разделению структурных элементов дермы и создает предпосылки для
придания полуфабрикату и готовой продукции требуемых физикомеханических свойств.
1 1 . 2 . Д е й с т в и е ф е р м е н т о в
н а в о л о к н о о б р а з у ю щ и е б е л к и ш к у р ы
Шкуру также можно представить как сложное многокомпонентное гистологическое образование, состоящее из волосяного покрова, эпидермиса, дермы и подкожной жировой ткани (рис. 11.4).
Эпидермис, как и волосяной покров, состоит в основном из кератина и в кожевенном производстве удаляется. Основной слой
шкуры – дерма – образован сложным переплетением в основном коллагеновых, а также эластиновых волокон.
Рис. 11.4. Основные компоненты живой кожи
Коллагеновые волокна дермы в подавляющем большинстве
представлены двумя типами коллагенов, характеризующимися
92
высоким содержанием гидроксипролина, низким содержанием
гидроксилизина, малым числом сайтов гликозилирования, широкими
фибриллами. Различие между типами состоит в присутствии
в некоторых полипептидных цепях неотщепленных концевых
пептидов, имеющих потенциальные места связывания (остатки
цистеина и лизина). Это способствует образованию различных
сетчатых структур, известных как «ретикулиновые волокна».
С целью унификации названий сложных белков и их многочисленных комплексов с различными небелковыми компонентами, а также
во избежание путаницы в дальнейших рассуждениях здесь следует привести ряд пояснений.
В связи с огромным разнообразием белков, различием их физических, химических свойств и биологических функций их строго научная классификация пока отсутствует. Систематизация и номенклатура
белков, за исключением ферментов, не существуют. В настоящее время
наиболее удачной следует считать классификацию белков по их структурным признакам с определенным сочетанием характерных физико-химических свойств. На основании такого подхода класс белковых веществ
подразделяется на две большие группы: протеины простые (белки) и
сложные, представляющие соединения простого белка с каким-либо веществом небелковой природы (простетической группой). И простые,
и сложные белки, в свою очередь, делят на ряд подгрупп. Причем название сложных белков определяется простетической группой.
Ранее все фибриллярные белки включали в подгруппы простых
белков – склеропротеинов, а в более поздних работах – протеноидов.
Однако в настоящее время никем не оспаривается, что основные фибриллярные белки кожевой ткани и волоса представляют собой гликозилированные продукты. Поэтому более правильно их отнести к гликопротеинам, что и наблюдается в современной научной и справочной
литературе.
1 1 . 2 . 1 . С т р о е н и е и с т р у к т у р а к о л л а г е н а
Коллаген является основным структурным белком межклеточного матрикса. Это фибриллярный белок, отличающийся от других
белков рядом особенностей.
93
Аминокислотный состав коллагена в значительной мере определяет его свойства и изменения, происходящие под действием физических факторов и химических реагентов. Данные, характеризующие
состав коллагеновых структур, представленные в табл. 11.1, типичны
для коллагена млекопитающих и птиц, но отличаются от аналогичных
показателей белка, выделенного из других организмов.
Присутствие остатков оксипролина, отсутствующего в других
белках, лежит в основе количественных методов определения содержания коллагена в животных тканях. Характерной особенностью первичной структуры коллагена является также низкое содержание остатков
ароматических аминокислот, отсутствие цистина и триптофана.
Наиболее характерная особенность коллагена проявляется в его
третичной структуре, представляющей правозакрученная суперспираль из трех α-цепей, при формировании которой остаток глицина оказывается в центре. Глицин – это единственная аминокислота, размер
которой позволяет ей поместиться под центральным ядром тройной
спиральной молекулы. Таким образом, центральное ядро этой тройной
суперспирали, называемой также би-спиралью или эликсом, состоит из
глициновых остатков всех трех α-субъединиц.
На протяжение одного витка би-спирали расположено в среднем 30 аминокислотных остатков. Таким образом, длина проекции одного такого витка на ось спирали составляет
0,286 ∙ 30 = 8,58 нм.
Расстояние между цепями отдельных α-спиралей равно 0,45 нм,
его также принимают за среднее расстояние между радикалами аминокислотных остатков. Расстояние между осями смежных трехспиральных спиралей в зависимости от влажности изменяется в пределах от
1,05 до 1,6 нм.
В коллагене млекопитающих около 100 X-положений заняты
пролином и около 100 Y-положений – 4-гидроксипролином. Эти «жесткие» аминокислоты ограничивают вращение полипептидного стержня
и таким образом увеличивают стабильность тройной спирали. Остатки
гидроксипролина придают структуре дополнительную стабильность за
счет образования большего количества внутримолекулярных водородных связей (для этого используются окружающие молекулы воды).
В некоторых X-положениях коллагена содержится также 3-гидроксипролин, а в Y-положениях – 5-гидроксилизин.
94
Таблица 11.1
Амино-
кислотный
остаток
Формула
Молекулярная масса
Содержание
аминокислот
г/100 г
белка
% **
Глицин
CH2(NH2)COOH
75
27,51
33,4
Аланин
CH3CH(NH2)COOH
89
10,34
10,7
Лейцин
(CH3)2CHCH2CH(NH2)COOH
131
3,99
2,8
Изолейцин
CH3CH2СH(CH3)CH(NH2)COOH
131
1,96
1,4
Валин
(CH3)2CHCH(NH2)COOH
117
3,10
2,4
Фенилаланин
C6H5CH2CH(NH2)COOH
165
2,26
1,3
Тирозин
HOC6H4CH2CH(NH2)COOH
181
0,80
0,4
Серин
CH2(OH)CH(NH2)COOH
105
3,70
3,2
Треонин
CH3CH(OH)CH(NH2)COOH
119
2,51
1,9
Метионин
CH3S(CH2)2CH(NH2)COOH
149
1,23
0,7
Аспаргиновая
кислота
HOCOCH2CH(NH2)COOH
133
7,15
4,9
Глютаминовая
кислота
HOOC(CH2)2CH(NH2)COOH
147
12,11
7,5
Пролин
С4Н8NCOOH
115
16,58
13,2
Оксипролин
HOС4Н7NCOOH
131
11,97
8,3
Аргинин*
NHC(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)COOH
174
9,59
5,0
Лизин*
NH2CH2(CH2)3CH(NH2)COOH
146
4,42
2,8
Оксилизин*
NH2CH2(CH2)2CHOHCH(NH2)COOH
162
1,07
0,6
Гистидин*
-N-CH-NHCH-C-CH2CH(NH2)COOH
155
1,02
0,6
Аминокислотный состав коллагена дермы млекопитающих
* – аминокислотные остатки с гидрофильной боковой цепью основного
характера;
**– от общего числа аминокислотных остатков.
Тройная спираль коллагена стабилизируется многочисленными
межцепочечными поперечными сшивками между лизиловыми
и гидроксилизиловыми остатками. Химическая природа этих перекрестных
связей рассматривается ниже. Такое строение способствует формированию
основной структурной единицы коллагена – тропоколлагеновой частицы.
Она представляет собой жесткую палочковидную структуру с диаметром
95
1,4 нм и длиной около 300 нм, с молекулярной массой 360 кДа (рис. 11.5).
Поскольку каждая цепь содержит 1000 аминокислотных остатков, вся
частица соответственно содержит 3000.
Рис. 11.5. Особенности молекулярной структуры коллагена
от первичной последовательности до фибрилл
В молекуле коллагена имеются кристаллические зоны, состоящие в основном из остатков глицина и иминокислот, и аморфные
(неупорядоченные) участки, не содержащие циклических остатков.
Молекулы коллагена могут ассоциироваться в различные агрегированные формы, образующие надмолекулярную или четвертичную
структуру. Коллагеновые фибриллы образуют продольные зигзагообразные структуры длиной чуть меньше ¼ длины тройной спирали.
Между концом одной тройной спирали и началом следующей имеется
пространство, которое может служить местом отложения кристаллов
гидроксилапатита при образовании кости. Диаметр коллагеновых фибрилл колеблется от 10 до 100 нм, и под микроскопом они видны в виде
пучков в экстрацеллюлярном матриксе соединительной ткани.
96
1 1 . 2 . 2 . С и н т е з к о л л а г е н а
Коллаген – внеклеточный белок, но он синтезируется в виде
внутриклеточной молекулы-предшественника, которая перед образованием фибрилл зрелого коллагена подвергается посттрансляционной
модификации. Наиболее ранним предшественником коллагена является препроколлаген, который содержит на N-конце лидерную, или сигнальную, последовательность примерно из 100 аминокислот. Препроколлаген образуется на рибосомах, прикрепленных к эндоплазматическому ретикулуму. Когда сигнальная последовательность проникает в
везикулярное пространство эндоплазматического ретикулума, лидерная последовательность отщепляется, а N-конец проколлагена продолжает продвигаться в этом пространстве. Здесь некоторые пролиновые
и лизиновые остатки подвергаются действию соответственно пролил4-гидроксилазы и лизилгидроксилазы и гидроксилируются с образованием оксипролина и оксилизина.
После гидроксилирования происходит гликозилирование при
участии специфических трасферазных ферментов, в результате которого к оксигруппам гидроксилизина О-гликозидной связью присоединяются галактоза или глюкоза.
Молекула проколлагена содержит на N- и С-концах пептиды
с мол. массой соответственно 20 кДа и 30–35 кДа, которые отсутствуют
в зрелом коллагене. Оба этих пропептида содержат остатки цистеина.
N-концевой пропептид образует только внутрицепочечные дисульфидные связи. С-концевые пептиды образуют как внутри-, так и межцепочечные дисульфидные связи. Вслед за образованием этих связей молекулы проколлагена собираются в тройную спираль (рис. 11.6). Образование дисульфидных мостиков между цепями считают одной из причин, вызывающих постепенное скручивание цепей в трехспиральную
структуру.
После формирования тройной спирали дальнейшее гидроксилирование пролиловых и лизиловых остатков становится невозможным. Гликозилтрансфераза, которая переносит глюкозу или галактозу
на остатки гидроксилизина, также может действовать только на α-цепи
проколлагена, не имеющей еще спиральной конфигурации.
97
Рис. 11.6. Внутриклеточные стадии синтеза коллагена
После завершения этого внутриклеточного процессинга молекулы гликозилированного проколлагена продвигаются к наружной поверхности клетки через комплекс Гольджи. Внеклеточные аминопротеаза и карбоксипротеаза проколлагена удаляют соответственно аминоконцевой и карбоксиконцевой пропептиды. Вновь образованные молекулы тропоколлагена содержат примерно 1000 аминокислот на цепь и
спонтанно собираются в коллагеновые микрофибриллы, неотличимые
от зрелых фибрилл, присутствующих в тканях (рис. 11.7)
Однако эти фибриллы не обладают силой напряжения зрелых
коллагеновых фибрилл до тех пор, пока не произойдет перекрестное
связывание их рядом ковалентных связей. Внеклеточный медь-содержащий фермент лизилоксидаза осуществляет окислительное дезаминирование ε-аминогрупп некоторых лизиловых и гидроксилизиловых
остатков коллагена с образованием реактивных альдегидов. Альдегиды
могут формировать Шиффовы основания с ε-аминогруппами других
98
лизинов, гидроксилизинов или даже гликозилированных гидроксилизинов. Эти Шиффовы основания подвергаются химической перегруппировке, обеспечивая стабильные ковалентные сшивки.
Рис. 11.7. Внеклеточные стадии образования коллагена
Альдегидный компонент, образующийся из гидроксилизина,
формирует более стабильную перекрестную связь, чем альдегид из лизилового остатка. Альдольные мостики также обеспечивают перекрестное связывание (сшивку) молекул. Данные о внутриклеточном и внеклеточном процессинге (созревании) молекулы-предшественника коллагена суммированы на рис. 11.6, 11.7. Порядок и локализацию этапов
процессинга коллагена, содержащего повторяющуюся структуру [Gly-
X-Y]n, можно представить следующим образом.
99
Внутриклеточные этапы:
1) отщепление сигнального пептида;
2) 4-гидроксилирование Y-пролиловых остатков;
3) 3-гидроксилирование X-пролила, где Y-остаток 4-гидрокси-
пролина;
4) 5-гидроксилирование Y-лизиловых остатков;
5) гликозилирование гидроксилизиловых остатков;
6) образование внутрицепочечных и межцепочечных S–S-связей;
7) образование тройной спирали проколлагена.
Внеклеточные этапы:
1) отщепление NH2-концевого пропептида (мол. массой 20 кДа);
2) отщепление СООН-концевого пропептида (мол. массой
30–35 кДа);
3) образование фибрилл незрелого коллагена;
4) окисление лизиловых, гидроксилизиловых и гликозилиро-
ванных гидроксилизиловых остатков в альдегиды;
5) перекрестное связывание цепей и спиральных молекул фиб-
рилл через Шиффовы основания и альдольную конденсацию.
Зрелый коллаген представляет собой гликопротеин, содержащий
сахариды, связанные с остатками гидроксилизина О-гликозидной связью.
Углеводные компоненты в структуре коллагена регулируют фибриллообразование, стабилизируют фибриллы, предотвращая их слипание и способствуя большей подвижности соединительной ткани дермы.
В настоящее время известны свыше 20 типов коллагена (изоколлагенов), отличающихся друг от друга по первичной структуре пептидных цепей, функциям и локализации. Пять типов коллагена являются фибриллообразующими. Остальные представляют собой либо ассоциированные с фибриллами прерывистые тройные спирали, либо
микрофибриллы, локализованные между крупными фибриллами фибриллообразующих коллагенов.
1 1 . 2 . 3 . Д е й с т в и е ф е р м е н т о в н а к о л л а г е н
Итак, в соединительной ткани, кроме зрелого нерастворимого
коллагена, присутствуют два его предшественника в биологических
условиях – троппоколлаген и проколлаген. Первый растворяется в
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]