Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
сигмоидности кривых насыщения. При n 1 говорят об отрицательной
кооперативности.
Когда скорость реакции равна половине максимальной (v= V
max
/2)
v/(V
− v) = 1,
max
log v/(V
− v) = 0.
max
Таким образом, чтобы определить величину S50 (концентрацию
субстрата, при которой скорость вдвое меньше максимальной), нужно
из точки на прямой, для которой
log v/(V
− v) = 0,
max
опустить перпендикуляр на ось х.
Рис. 6.7. Графический способ определения концентрации субстрата,
при которой скорость реакции составляет половину максимальной,
в условиях сигмоидного характера кинетической кривой
6 . 7 . А к т и в а т о р ы и и н г и б и т о р ы ф е р м е н т о в
Активность ферментов зависит от присутствия в среде некоторых химических соединений, называемых ферментативными эффекторами. Среди них различают ингибиторы и активаторы, которые
51
соответственно замедляют или ускоряют ферментативную реакцию.
Действие этих веществ очень специфично, активатор одного фермента может быть ингибитором для другого и наоборот. В качестве
активаторов чаще всего выступают ионы металлов, восстановители,
двухвалентные катионы, соли олеиновой кислоты, альбумин, синильная кислота и др. Роль активаторов может быть следующей:
1) защита молекулы фермента от инактивирующих воздей-
ствий;
2) образование с субстратом комплексов, которые более эф-
фективно связываются с активным центром фермента;
3) разъединение субъединиц фермента, имеющего четвертич-
ную структуру, с открытием доступа субстрату к активному центру.
Ингибиторами ферментов преимущественно являются соли
тяжелых металлов, сильные окислители (галогены), соли синильной,
пирофосфорной и фтористоводородной кислот, органические основания. Например, трипсин инактивируется гексафторсиликатом
натрия, а протеиназы плесневого гриба – хлорамином. Собственно,
процесс ингибирования – это полное или частичное подавление активности фермента при сохранении его первичной и пространственной структуры.
Существуют несколько классификаций ингибиторов ферментативной активности. Самая распространенная основана на том,
ослабляется или не ослабляется ингибирующее действие при повышении концентрации субстрата. В первом случае ингибиторы и процессы с их участием называют конкурентными, во втором – некон-
курентными. Химическая структура конкурентного ингибитора
обычно сходна со структурой субстрата, и он может взаимодействовать с активным центром фермента, т. е. конкурировать за него с субстратом. При этом степень ингибирования зависит от соотношения
концентраций субстрата и ингибитора, поэтому действие ингибитора может быть снижено или устранено повышением концентрации
субстрата.
Классическим примером конкурентного ингибирования служит конкуренция между янтарной кислотой или ее эфирами – сукцинатами (субстрат) и малоновой кислотой или малонатами (ингибитор) (рис. 6.8).
52
Рис. 6.8. Реакция образования фумарата под действием фермента
сукцинатдегидрогеназы
Фермент сукцинатдегидрогеназа катализирует образование фумарата в результате отщепления атома водорода от каждого из двух углеродных атомов сукцината (рис. 6.8).
Малонат также способен связываться с дегидрогиназой, но при этом
отщепление атома водорода произойти не может. Комплекс фермента с ингибитором может распадаться на свободный фермент и ингибитор (I).
Для этой обратимой реакции
k+1
Е − I ↔ E + I,
k
−1
константа равновесия равна
Кi = [E] [I]/[E − I] = k1/ k−1.
Скорость образования продукта зависит от концентрации комплекса E–S. Предположим, что I очень прочно связывается с ферментом,
т. е. Кi – мала. Тогда количество свободного фермента Е, который мог бы
присоединять S, образуя комплекс E–S, а затем и Е + Р, будет весьма мало.
Соответственно и скорость реакции образования Р будет также незначительна. По аналогичным причинам при той же концентрации ингибитора,
но слабо связывающегося с S (Кi велика), катализируемая реакция существенно не замедлиться. Далее предположим, что при фиксированной концентрации ингибитора добавляется все большее количество субстрата.
Это повышает вероятность образования комплекса E─S по сравнению с
комплексом E–I. С ростом отношения [E–S]/[E–I] будет расти и скорость
реакции. При достаточно высокой концентрации S концентрация
53
комплекса E–I станет исчезающее мала. Но тогда скорость катализируе-
мой реакции будет практически такой же, что и в отсутствие I (рис. 6.9).
На рис. 6.9 представлен типичный случай конкурентного ингибирования, представленный в форме графика Лайнуивера–Бэрка. Скорость реакции (v) измеряется при разных значениях концентрации S и
при фиксированной концентрации ингибитора. Прямые, проведенные
через экспериментальные точки, пересекаются в одной и той же точке
на оси y. Длина отрезка, отсекаемого от оси y, равна 1/ V
. Это озна-
max
чает, что при бесконечно большой концентрации S (1/[S] = 0), v будет
такой же, что и в отсутствие ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого от оси х (а эта величина определяет значение К
ствии ингибитора уменьшается (−1/К’
−1/Км).
м
), в присут-
м
Рис. 6.9. График Лайнуивера–Бэрка для случая классического
конкурентного ингибирования
Таким образом, конкурентный ингибитор повышает кажущееся
значение Км (К’м) для субстрата. Для простого конкурентного ингибирования длина отрезка, отсекаемого от оси х, будет равна
х = 1/ Км (1+ [I]/ Кi ).
Определив Км в отсутствие I, можно найти из этого уравнения
Кi. Если концентрация добавленного ингибитора значительно превы-
шает концентрацию фермента, то можно считать [I] равной концентрации добавленного ингибитора. Значения Кi для конкурентных ингибиторов показывают, какой из них наиболее эффективен. Ингибиторы
54
с наименьшими Кi даже при малых концентрациях могут оказывать
сильное ингибирующее действие.
В случае неконкурентных ингибиторов конкуренция за связь
с каталитическим центром фермента между S и I отсутствует. При этом
ингибитор обычно ничем не напоминает субстрат и связывается с другим участком фермента. Неконкурентные ингибиторы в большинстве
случаев вызывают необратимые процессы. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают максимальную скорость, достижимую при
данном количестве фермента (V
), но, как правило, не влияют на Км.
max
Поскольку S и I связываются с разными центрами, возможно образование как комплекса E–I, так и комплекса E–IS. Последний также может
распадаться с образованием продукта реакции, однако с меньшей скоростью, чем фермент-субстратный комплекс Е–S, поэтому реакция будет замедляться, но не остановится.
На рис 6.10 представлена зависимость 1/v от 1/[S] в присутствии
и в отсутствии ингибитора. Предполагается, что связывание неконкурентного ингибитора не приводит к существенным изменениям в работе активного центра.
Рис. 6.10. График Лайнуивера–Бэрка для случая обратимого
неконкурентного ингибирования
Необратимое ингибирование сопровождается разрушением или
модификацией R-групп фермента, что приводит к безвозвратной потере активности. Необратимые ингибиторы инактивируют фермент,
образуя с его аминокислотными остатками или другими компонентами
структуры химическую связь. Обычно это ковалентная связь с одним
из участков активного центра.
55
Такой комплекс практически не диссоциирует в физиологических условиях. Например, иодацетамид необратимо реагирует с активными SH-группами ферментов:
E–SH + ICH2CONH2 ---> E–S–CH2CONH2 + HI.
В другом случае ингибитор нарушает конформационную структуру молекулы фермента, вызывая его денатурацию. Необратимые неконкурентные ингибиторы за результат их воздействия часто называют
«ферментными ядами». Их действие часто сложно отличить от влияния
неконкурентных обратимых ингибиторов, поскольку кинетические закономерности указанных реакций сходны.
Кроме упомянутых видов ингибирования, возможно торможение ферментативной реакции, наблюдаемое при избыточной концентрации субстрата (субстратное ингибирование). В этом случае в результате реакции фермента одновременно с двумя молекулами субстрата
образуется неактивный фермент-субстратный комплекс.
На действие некоторых ферментов влияет окислительно-восстановительный потенциал среды. Многие сульфгидрильные ферменты, например, катепсин, содержащий группы –S–S–, действуют
только тогда, когда последние находятся в виде SH-групп, т. е. в восстановленном состоянии.
Вопросы и задания
1. Что такое ферментативная кинетика?
2. В чем выражается лабильность ферментов, обусловленная их
белковой природой?
3. Как влияет температура на белковую часть фермента?
4. Как описывается зависимость каталитической активности
фермента от температуры реакции?
5. Что такое температурный оптимум ферментов?
6. Какой обычно температурный оптимум у ферментов расти-
тельного и животного происхождения?
7. Какое влияние на ферменты оказывает понижение температуры?
8. Какие факторы определяют зависимость активности фер-
мента от рН?
9. При каких значениях рН большинство ферментов имеют мак-
симальную активность?
56
10. Что будет происходить при низких и высоких значениях рН
при взаимодействии отрицательно заряженного фермента с положительно заряженным субстратом?
11. Начертите график зависимости активности фермента от рН.
12. Какие характерные свойства имеет реакция, протекающая в
равновесных условиях?
13. От чего зависит начальная скорость реакции?
14. Чему равна константа равновесия?
15. Изобразите графически зависимость скорости реакции от
концентрации субстрата.
16. При каком соотношении субстрата и фермента протекает
большинство ферментативных реакций?
17. Напишите уравнение стационарной кинетики ферментативных реакций.
18. Какое соотношение констант обозначается как Км? Что из
себя представляет эта величина? Как ее можно найти? Какую размерность она имеет?
19. Чему будет пропорциональна начальная скорость реакции,
в случае если концентрация субстрата значительно ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной?
20. Как и для чего строится график Лайнуивера–Бэрка?
21. Напишите уравнение Иди–Хофсти. Для чего его используют?
22. Каким образом судят о сродстве фермента к субстрату?
23. Как определяется концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, в случае если график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата носит
сигмоидный характер?
24. Что такое ферментативные эффекторы?
25. Какие вещества чаще всего выступают в роли активаторов
ферментов?
26. Какие вещества ингибируют ферментативные реакции?
27. Что значит «конкурентные» и «неконкурентные» ингибиторы?
28. Начертите график Лайнуивера–Бэрка для случая классического конкурентного ингибирования. Для определения каких величин
его используют?
29. Начертите График Лайнуивера–Бэрка для случая обратимого неконкурентного ингибирования.
30. За счет образования какой связи обычно происходит необратимое ингибирование фермента?
57
7 . Х АРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
В ферментативных процессах кожевенного и мехового производства чаще всего используются ферменты, относящиеся к трем подклассам ферментов класса гидролаз. Это ферменты, действующие на
сложноэфирные связи – эстеразы (КФ 3.1); действующие на гликозидные соединения – гликозидазы (КФ 3.2) и действующие на пептидные
связи – протеазы (КФ 3.4).
7 . 1. П р о т е о л и т и ч е с к и е ф е р м е н т ы
Протеолитические ферменты или протеазы относятся к четвертой группе 3 класса и по систематической номенклатуре называются
3.4 пептид-гидролазы. Они катализируют распад и синтез пептидной
связи (-СО–NH-), а следовательно, гидролиз белков и полипептидов по
следующей схеме:
-NHCH(R1)CO----NHCH(R2)CO- + H2O→
→
NHCH(R1)COOH + NH2CH(R2)CO-
Согласно первоначальной классификации протеолитические
ферменты делили на две группы: протеиназы и пептидазы. При этом
считали, что протеиназы действуют на белки, расщепляя их до полипептидов; полипептиды же гидролизуются пептидазами до аминокислот. Более поздняя классификация, до сих пор сохранившая свое значение, основана на схеме, предложенной М. Бергманом и Д. Фрутоном
(1937 г.). Согласно этой схеме протеазы разделяются на эндо- и экзо-
пептидазы. Ферменты первой группы (эндопептидазы) могут гидролизовать глубинные пептидные связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты. Ферменты второй группы (экзопептидазы) не
могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи, и
действуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну задругой концевые аминокислоты.
58
Таким образом, в соответствии с существующей классификацией в подклассе протеаз имеются подподклассы экзопептидаз (пептидаз) – номера 3.4.11-15 и эндопептидаз (протеиназ) – номера 3.4.21-24.
Первой подгруппе пептидаз присвоен номер 11 с тем, чтобы исключить путаницу с утратившими силу прежними классификациями.
С 16 по 20 позицию подподкласса в номенклатуре сделан пропуск с учетом будущих открытий ферментов, гидролизующих пептиды.
Схема классификации пептидгидролаз представлена на рис. 7.1.
Рис. 7.1. Схема классификации пептид-гидролаз
Пептидазы разделены, в соответствии с их специфичностью на
отщепляющие отдельные аминокислоты от N-конца или С-конца пептидной цепи.
К группе ферментов, входящих в 11-й подподкласс (КФ 3.4.11),
относят -аминоацилпепдидгидролазы (аминопептидазы), которые гидролитически расщепляют первую с N-конца пептидную связь. Группа
КФ 3.4.12 – гидролазы пептидаминокислот или гидролазы ациламинокислот (карбоксипептидазы) – объединяет ферменты, действующие на
первую пептидную связь с С-конца. Ферменты группы КФ 3.4.13 – дипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды (дипептидазы); групп
КФ 3.4.14 – дипептидилпептидгидролазы (дипептидилпептидазы) и
КФ 3.4.15 – пептидилдипептидгидролазы (пептидилдипептидазы) – гидролизуют дипептиды соответственно с N- и С-конца.
59
Деление протеиназ основано на особенностях механизма катализа, установленного по функционированию активного центра фермента или влияния рН на его активность. Эта группа ферментов имеет
четыре подподкласса – с 21 по 24.
Ферменты подгруппы (подподкласса) 3.4.21, называемые «сериновыми протеиназами», имеют в активном центре по остатку гистидина, серина и аспаргиновой кислоты. Они ингибируются агентами,
взаимодействующими с остатком серина. Все сериновые протеиназы
проявляют максимальную активность в нейтральной или щелочной
среде. Молекулярная масса составляет от 12–15 кДа у ферментов
с единственной полипептидной цепью до 200–300 кДа у ферментов
с субъединичной структурой.
Ферменты подгруппы 3.4.22, называемые SH- или тиоловые
протеиназы, имеют в активном центре SH-цистеина. Здесь представлен
ряд протеиназ растительного (папаин, бромелаин фицин, химопапаин)
и микробного происхождения.
Ферменты подгруппы 3.4.23 имеют оптимум действия при рН
ниже 5 и называются кислые протеиназы (карбоксильные). В каталитическом акте у этих ферментов участвуют остатки дикарбоновых аминокислот. Наиболее известными в этом подподклассе являются ферменты
пепсин, катепсин и ряд кислых протеиназ микробного происхождения.
Ферменты подгруппы 3.4.24 являются металлопротеидами (металлосодержащие). В основном это микробные нейтральные и некоторые протеиназы животного происхождения.
В классификации и номенклатуре протеолитических ферментов
выделена еще одна, третья группа протеиназ, которые включены в подподкласс КФ 3.4.99. Это свыше 30 протеиназ с неизвестным механизмом катализа, среди которых в основном протеиназы микробного происхождения, но есть и животные протеиназы. Создание этого подподкласса вызвано тем, что многие протеиназы обладают близкой, но не
полностью изученной и определенной специфичностью. Они действуют на один и тот же субстрат, однако продукты гидролиза отличаются не только количественно, но и качественно.
Субстратная специфичность протеиназ будет определяться
следующими факторами: природой аминокислоты, образующей
гидролизуемую пептидную связь; радикалами аминокислот, удаленными
от гидролизуемой пептидной связи; общей пространственной
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]