Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ферменты в технологиях кожи и меха. Учебное пособие
.pdf
Специфичность действия ферментов. Специфичность – одно
из наиболее выдающихся качеств ферментов. Это их свойство было
открыто еще в прошлом столетии, когда было сделано наблюдение,
что очень близкие по структуре вещества, а именно, метилглюкозиды,
представляющие собой пространственные изомеры, расщепляются по
эфирной связи двумя совершенно разными ферментами.
Таким образом, ферменты могут различать химические соединения, отличающиеся друг от друга очень незначительными деталями
строения, такими, например, как пространственное расположение метоксильного радикала и атома водорода при 1-м углеродном атоме молекулы метилглюкозида.
По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент подходит к субстрату, как ключ к замку.
Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 г.,
поскольку специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного
центра фермента. Топография активного центра фермента, обладающего абсолютной специфичностью, не только высоко упорядочена, но
и жестко закреплена. Активному центру этого фермента соответствует
топография одного единственного субстрата, поэтому только он и может подвергаться действию активного центра.
Модель Фишера, которую иногда называют моделью «жесткой
матрицы» (рис. 5.1), до настоящего времени не утратила своего значения для понимания некоторых свойств ферментов, например их способности к строго определенному связыванию двух или большего числа
субстратов. Тем не менее многие ферменты обладают лишь относительной специфичностью. Они способны катализировать один тип реакции с более чем одним структурно-подобным субстратом. В этом
случае конформация белка, в особенности ориентация активного центра, должна быть способна к небольшим, но существенным изменениям. Такой фермент должен обладать в области активного центра
определенной гибкостью. Эта идея была впервые выдвинута Кошландом в шестидесятые годы прошлого столетия в его теории индуцированного соответствия. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может
быть выражено формулой «перчатка – рука» (рис. 5.1).
31
Рис. 5.1. Взаимодействие субстрата и фермента
При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и он таким образом подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. По этой теории R-группы в районе активного центра слегка меняют свою ориентацию, чтобы связать субстрат.
В зависимости от конформационной подвижности активного центра
фермент способен взаимодействовать с немногими либо с самыми разнообразными субстратами. Представления о том, что ферменты (и вообще белки) способны принимать различные конформации, что приводит к изменению их свойств, широко используются в биохимии
и имеют большое значение для объяснения многих процессов. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении гибкости активного центра
фермента, удовлетворительно объясняла активирование и ингибирование действия ферментов, регуляцию их активности при воздействии
32
конформационные перестройки в ферменте в процессе изменения его активности Кошланд сравнивал с колебаниями паутины, когда в нее попала
добыча (субстрат), подчеркивая этим крайнюю лабильность структуры
фермента в процессе каталитического акта.
В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется
гипотезой топохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимоиндуцированной настройки субстрата и фермента,
она фиксирует внимание на том, что специфичность действия ферментов объясняется, в первую очередь, узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают многочисленные точечные
гидрофобные взаимодействия и водородные связи.
Некоторые ферменты проявляют стереоспецифичность, т. е. действуют на определенный стереоизомер. Удивительным типом стереоспецифичного катализа является способность ферментов по-разному взаимодействовать с химически идентичными группировками субстрата.
Например, глицерокиназа, катализатор превращения глицерина в глицерофосфат, определяет перенос фосфатной группы на углерод С3 с образованием L-изомера, несмотря на то, что события получения L- и D- изомеров равновероятны. Таким образом, идентичные группы в микроокружении активного центра становятся различимыми (рис. 5.2).
Рис. 5.2. Реакция превращения глицерина в глицерофосфат
под действием катализатора
Вопросы и задания
1. Дайте определение ферментам.
2. Какую модель используют для определения роли фермента
в ферментативных реакциях?
33
3. Почему во время ферментативной реакции субстрат утрачи-
вает способность удерживаться в активном центре?
4. Из каких этапов складывается акт катализа?
5. Какое условие должно соблюдаться для оптимальной кон-
формации и максимальной активности фермента?
6. Какие условия являются приемлемыми для большинства фер-
ментов как белков?
7. Как вы понимаете термин «специфичность» применительно
к ферментам?
8. Могут ли ферменты различать химические соединения, отли-
чающиеся друг от друга очень незначительными деталями строения?
9. Как взаимодействуют фермент и субстрат по правилу Фишера?
10. Как взаимодействуют фермент и субстрат согласно модели
Кошланда?
11. Какие изменения происходят с R-группами в районе актив-
ного центра чтобы связать субстрат?
12. Какой теорией в настоящее время вытесняется теория Ко-
шланда?
13. Какие связи и взаимодействия возникают при ферментативном катализе между субстратом и субстратным центром фермента согласно одной из теорий взаимодействия субстрата и фермента?
14. Как вы понимаете термин «стереоспецифичность»?
15. Способны ли ферменты принимать различные конформации?
34
6 . КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Под ферментативной кинетикой понимают зависимость скорости реакции от концентрации фермента и субстрата и условий их взаимодействия, таких как температура, реакция среды, наличии активаторов и ингибиторов и т. д.
Белковая природа ферментов обусловливает их лабильность,
которая выражается в том, что ферменты теряют активность под влиянием некоторых факторов, важнейшими из которых являются температура и реакция среды.
6 .1. Т е р м о л а б и л ь н о с т ь ф е р м е н т о в
Термолабильность, или термонеустойчивость, выражается
в чувствительности ферментов, находящихся в обводненном состоянии, к высокой температуре.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура,
с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента и приводит
при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению каталитической функции. С другой стороны, оказывает влияние на скорость
реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.
Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой. До некоторого значения температуры (в среднем до 50 °С) каталитическая активность растет, причем на
каждые 10 °С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования
субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 5 °С денатурация ферментного белка резко усиливается и,
хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.
Детальные исследования роста активности ферментов
с повышением температуры показали более сложный характер этой
зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает
правилу удвоения активности на каждые 10 °С в основном из-за
35
постепенно нарастающих конформационных изменений в молекуле
фермента. Температура, при которой каталитическая активность
фермента максимальна, называется его температурным оптимумом.
Температурный оптимум для различных ферментов неодинаков. В общем
для ферментов животного происхождения он лежит между 40 и 50 °С,
а растительного – между 50 и 60 °С. Однако есть ферменты с более
высоким температурным оптимумом, например, у папаина (фермент
растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум
находится при 80 °С. Известен ряд термостабильных ферментов,
выдерживающих нагревание до 100 °С, например, миокиназа – фермент,
находящийся в мышцах. В то же время у каталазы (фермент, ускоряющий
распад Н2О2 до Н2О и О2) оптимальная температура действия находится
между 0 и −10 °С, а при более высоких температурах происходит
энергичное окисление фермента и его инактивация. Степень инактивации
ферментов зависит не только от температуры, но и от длительности ее
воздействия. Например, фермент поджелудочного сока – трипсин после
инактивации нагреванием при последующем охлаждении со временем
восстанавливает свою активность самопроизвольно.
Ферменты очень устойчивы к низким температурам. Ее понижение даже до температуры жидкого воздуха вызывает лишь временную потерю активности, которая восстанавливается при нагревании до
оптимальной температуры. Характерная зависимость активности фермента от температуры представлена на рис. 6.1.
Рис. 6.1. Влияние температуры на относительную активность
ферментов
36
При обработке ферментами кожевенного и мехового сырья
необходимо учитывать, что с повышением температуры может произойти сваривание коллагена дермы, поэтому процессы проводят в интервале температур 38–40 °С.
6 . 2 . В л и я н и е р Н с р е д ы н а а к т и в н о с т ь
ф е р м е н т о в
Зависимость активности фермента от значения рН среды была
установлена в середине ХХ в. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную
активность. Большинство ферментов имеют максимальную активность
в зоне между рН 5,0 и 9,0. Вместе с тем отдельные ферменты, например
пепсин, активны при значениях рН, лежащих далеко за пределами этого
интервала.
Зависимость активности от рН определяется следующими факторами:
1. Денатурацией фермента при очень высоких или очень низких рН.
2. Изменением величины заряда молекул субстрата или фер-
мента.
Активность фермента может меняться в результате нарушения
его структуры либо изменения заряда функциональных остатков,
участвующих в катализе или связывании субстрата. В качестве примера
рассмотрим взаимодействие отрицательно заряженного фермента (Е–)
с положительно заряженным субстратом (S+)
Е− + SН+ → Е ─ SН.
При низких рН происходит протонирование аниона фермента:
Е− + Н+ → ЕН,
а при высоких – депротонирование субстрата:
SН+ → S + Н+.
37
Поскольку взаимодействовать друг с другом могут только иони-
Фермент
Оптимальное значение рН
Пепсин
1,5–2,5
Трипсин
7,8–8,5
Катепсин
3,0–5,0
Липаза поджелудочной железы
7,0–8,5
Кератиназа микробного происхождения
(Str. Fradiae)
9
зированные формы реагентов, при крайних значениях рН их эффективная концентрация будет понижена, что скажется на снижении скорости
реакции. На рис. 6.2 показано влияние рН на активность фермента.
В нужном ионизированном состоянии оба реагента будут находиться
в области, ограниченной кривой и осью абсцисс (концентраций). Причем
их максимальная концентрация наблюдается в точке Х, значение рН
в которой будет соответствовать и максимальной активности фермента.
Рис. 6.2. Влияние рН на активность ферментов
Как было отмечено ранее, изменение рН может приводить
к конформационным изменениям фермента. Для поддержания активной третичной или четвертичной структуры может оказаться необходимым присутствие определенного заряда на одной из R-групп, удаленной от области связывания субстрата, но влияющей на сохранение этой
структуры. Оптимальные значения рН для некоторых ферментов представлены в табл. 6.1.
Таблица 6.1
Оптимальные значения рН ферментов
38
6 . 3 . К о н ц е н т р а ц и я р е а г е н т о в и к о н с т а н т а
р а в н о в е с и я
При увеличении концентраций реагентов возрастает число молекул, обладающих достаточной для реакции энергией, а также частота
их столкновений. При проведении реакции между двумя реагентами:
А + В → АВ,
удвоение концентраций А или В приведет к увеличению скорости реак-
ции в два раза, а одновременное удвоение концентраций А и В повысит
вероятность их столкновений в четыре раза. Следовательно, скорость
реакции возрастет вчетверо. Таким образом, скорость реакции пропорциональна концентрациям реагирующих молекул:
скорость реакции ~ [А][В].
Квадратными скобками пользуются для обозначения молярных
концентраций реагентов. Более точно было бы обозначать их молярные
активности, поскольку не каждое столкновение приводит к желаемому
результату. Однако далее для простоты рассуждений оставим общепринятое обозначение.
Если n молекул А реагируют с m молекул В,
nА + mВ → АnВm,
то выражение для скорости реакции принимает следующий вид:
скорость реакции ~ [А]n[В]m.
Знак пропорциональности ~ можно заменить на знак равенства,
если ввести коэффициент пропорциональности k. Для обратимой реакции, какими являются большинство реакций с участием ферментов, выражения для скоростей прямой (1) и обратной (–1) реакций принимают
следующий вид:
скорость1 = k1[А]n[В]m;
скорость−1 = k−1 [АnВm].
39
Когда скорости прямой и обратной реакций равны, говорят, что
система находится в равновесии.
скорость1 = скорость−1;
k1[А]n[В]m = k−1 [АnВm].
Отношение, k1/ k−1 называется константой равновесия kр:
kр = k1/ k−1 = [АnВm]/ [А]n[В]m.
Система, находящаяся в равновесии, обладает характерными
свойствами.
1. Константа равновесия равна отношению констант прямой и
обратной реакций.
2. В равновесии равны скорости прямой и обратной реакции, но
не их константы.
3. Равновесие является динамическим состоянием. При этом
суммарного изменения концентрации реагентов и продуктов в состоянии равновесия не происходит, А и В постоянно превращаются в АnВm
и наоборот.
4. Если известны равновесные концентрации А, В и АnВm, можно
найти численное значение константы равновесия.
Как было отмечено выше, зная kр, можно вычислить стандарт-
ное изменение свободной энергии G °.
Если kр больше единицы, реакция идет самопроизвольно, т. е.
в том направлении, как она написана (слева направо). Если же
kр меньше единицы, то самопроизвольно идет обратная реакция. Таким
образом, kр указывает направление, в котором реакция может идти самопроизвольно, но не позволяет судить, будет ли реакция идти быстро.
Иными словами, она ничего не говорит о высоте энергетического барьера. Это следует из того, что kр определяет только G °, а скорости реакций зависят от высоты энергетического барьера, т. е. от значения
энергии активации.
Большинство факторов, влияющих на скорость ферментативных реакций, оказывают свое действие путем изменения локальных
концентраций реагентов.
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]