Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие
.pdf
71
Dreamer и George Church независимо открыли, что одноцепочечная ДНК
(ssDNA) может быть секвенирована путем прохождения через нанопоры.
Принцип работы секвенсоров с помощью нанопор основан на измерении элек-
трического тока при прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через нанопору. Детектирование осуществляется в камере с разделенной мембраной, содержащей нанопору. К камере прикладывается напряжение, заставляющее ДНК
или РНК двигаться через пору. По мере прохождения молекулы сечение поры
уменьшается, в результате чего уменьшается сила тока. Таким образом, измеряя ток, можно определить тип нуклеотида, проходящего через пору в задан-
ный интервал времени (рис. 35).
Рис. 35. Белковая нанопора, закрепленная в бислойной мембране
В текущей ситуации полногеномное секвенирование в клинике используют для поиска крупных структурных изменений хромосом (не менее
100 тыс. п.н.), и оно хорошо подходит для неинвазивного скрининга. К полно-
экзомному секвенированию в клинике чаще всего прибегают, когда остальные
методы генетической диагностики себя исчерпали. Он дает возможность осу-
ществления поиска новых генов-кандидатов при различных патологиях. Паци-
ент, которому было выполнено полноэкзомное секвенирование, сможет в даль-
нейшем вернуться к своим результатам, чтобы, например, выяснить, может ли
72
ему быть назначена та или иная терапия исходя из обнаруженных у него поли-
морфизмов, влияющих на метаболизм лекарственных средств.
Принципиально различают прямую и косвенную ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней.
Прямые методы используются при условии, что ген заболевания клонирован, известны его экзон-интронная организация или нуклеотидная последо-
вательность полноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике
предметом анализа являются мутации гена. Если мутации известны, то можно
их выявлять либо с помощью ферментов-рестриктаз, которые распознают стро-
го определенные нуклеотидные последовательности, либо на основе ДНК-
гибридизации. К числу таких методов относят рестрикционный анализ. Его
суть состоит в том, что рестрикционные эндонуклеазы разрезают двойную нить
ДНК в определенных последовательностях из 4–8 нуклеотидов. Разрезание мутантной ДНК дает участки, отличающиеся по длине от нормальных участков,
что и выявляется на электрофореграмме (рис. 36).
Рис. 36. Рестрикционный анализ
Если в состав сайта рестрикции входит полиморфный нуклеотид, эту мутацию можно выявить абсолютно достоверно. Если полиморфные нуклеотиды
лежат в неузнаваемых рестриктазой участках, то метод рестрикционного анали-
за неприменим. Аллель-специфическая ПЦР используется для выявления точ-
ковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах. ПЦР
позволяет многократно увеличить уникальную последовательность ДНК, а за-
тем проанализировать ее на предмет мутации. С помощью специфических оли-
гонуклеотидных праймеров проводят амплификацию кодирующих участков геномной ДНК. Наряду с двумя разобранными выше прямыми методами детек-
ции известных мутаций широко применяется ПЦР в реальном времени.
73
Если характер мутации неизвестен, а клиническая картина заболевания
позволяет предположить, в каких генах могла произойти мутация, то в лабора-
торной диагностике применяются следующие методы мутационного скрининга:
анализ перестроек ДНК-блотингом по Саузерну, анализ полиморфизма конформации одноцепочечной ДНК, гетеродуплексный анализ, электрофорез
двухцепочечной ДНК в градиенте денатуранта и др.
Преимущества прямых методов:
– практически 100 %-ная точность диагностики;
– отсутствие необходимости ДНК-анализа всех членов ядерной семьи;
– возможность выявления гетерозиготного носительства патологических
мутаций у родителей умершего больного и его родственников, что особенно ак-
туально для аутосомно-рецессивных заболеваний.
Недостаток: требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-интронной структуры и спектра его мутаций (такая ин-
формация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека).
Косвенные методы ДНК-диагностики применяют в том случае, если ген,
повреждение в котором приводит к заболеванию, не идентифицирован, а лишь
локализован на определенной хромосоме, или когда методы прямой ДНКдиагностики не дают результата (например, при значительной протяженности
и сложной молекулярной организации гена, а также широком спектре патоло-
гических мутаций в нем).
Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сегрегации
в семье аллелей полиморфных маркеров, находящихся в том же хромосомном
регионе или тесно сцепленных с локусом заболевания. Полиморфные маркеры,
используемые для косвенной ДНК-диагностики, представляют собой точковые
замены, делеции/инсерции, повторы, полиморфизм которых обусловлен раз-
личным количеством элементов в блоке.
Наиболее удобными для косвенной ДНК-диагностики признаны микроса-
теллитные (мономер до 5 п.н.) и минисателлитные (мономер повтора состоит из
5–60 п.н.) полиморфные маркеры, широко распространенные в геноме челове-
ка. Для большинства известных в настоящее время полиморфных сайтов такого
типа был строго показан менделевский характер наследования. Технические
приемы в косвенной диагностике те же самые, что и в прямой (получение ДНК,
рестрикция, электрофорез и т. д.). К этому приему добавляется математический
анализ сцепления признаков.
74
Преимущества косвенных методов:
– не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нем, необходимо только иметь сведения о его локализации;
– информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку
всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом
заболевания, найти информативный для данной семьи.
Недостатки:
– нет 100 %-ной точности;
– необходимость семейного анализа и обязательной уверенности в клиническом диагнозе;
– могут быть применены только для монолокусных заболеваний и неэффективны для моногенных полилокусных болезней.
75
11. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА
Пренатальная диагностика наследственных болезней — комплексная
дородовая диагностика с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Пренатальная диагностика связана с решением ряда био-
логических и этических проблем до рождения ребенка, так как при этом речь
идет не об излечении болезни, а о предупреждении рождения ребенка с патоло-
гией, не поддающейся лечению (обычно путем прерывания беременности
с согласия женщины). При современном уровне развития пренатальной диагностики можно установить диагноз всех хромосомных болезней, большинства
врожденных пороков развития, энзимопатий. Часть из них можно установить
практически в любом сроке беременности (хромосомные болезни), часть — после 12-й недели (редукционные пороки конечностей, атрезии, анэнцефалию),
часть — только во второй половине беременности (пороки сердца, почек).
Для проведения пренатальной диагностики необходим отбор материала
для исследований. Используют следующие способы (под контролем УЗИ):
– хорионбиопсию на 8-й неделе беременности (биопсию клеток ворсин
хориона);
– плацентобиопсию на 12-й неделе (клетки плаценты);
– амниоцентез на 15–18-й неделе (амниотическая жидкость);
– кордоцентез на 18–22-й неделе (из кровеносных сосудов пуповины).
Хорионбиопсия и плацентобиопсия позволяют производить наиболее
раннюю диагностику, но риск осложнений достигает 3 %. Кордоцентез произ-
водится слишком поздно, что затрудняет повторные исследования в случае сомнений. Поэтому среди методов, позволяющих диагностировать заболевание до
рождения ребенка, ведущее место занимает амниоцентез — получение ам-
ниотической жидкости и клеток плода с помощью прокола плодного пузыря
(рис. 37).
Показания для пренатальной диагностики:
– возраст женщины 35 лет и старше (мужчин 45 лет и старше);
– наличие в семье наследственной болезни;
– неблагоприятный акушерский анамнез (повторные спонтанные прерывания беременности или рождение ребенка с врожденными пороками развития);
– сахарный диабет, эпилепсия, инфекции у беременной;
– лекарственная терапия;
– контакты с тератогенными факторами.
76
Рис. 37. Способы получения материала для исследований
Пренатальная диагностика должна включать два этапа. Первый этап —
выявление и отбор семей с повышенным риском неблагополучного в генетиче-
ском плане исхода беременности. Второй этап — уточняющая пренатальная
диагностика. Любые методы уточняющей диагностики применяют только
у женщин с факторами риска.
Методы пренатальной диагностики:
1. Скрининговые (медико-генетическое консультирование, определение
уровня α-фетопротеина (АФП) в сыворотке крови беременной, хорионического
гонадотропина (ХГЧ), неконъюгированного эстриола, ацетилхолинэстеразы
и др.). Биохимический скрининг беременных проводится для выявления наследственных болезней у плода.
В I триместре беременности проводится скрининг по ряду показателей.
Белок PAPP-A — фермент, вырабатываемый фибробластами плаценты, кото-
рый отщепляет фрагменты от инсулиноподобного фактора роста, повышая его
активность и обеспечивая тем самым стимуляцию роста и развития плаценты.
В норме содержание PAPP-A повышается с 8 по 14 неделю от 1 до 8 ММЕ/мл.
Низкий уровень PAPP-A отмечен при синдромах Дауна, Патау, Эдвардса. Хорионический гонадотропин человека — гликопротеин, относящийся к гонадотропным гормонам. Состоит из α- и β-субъединиц, α-субъединица идентична
α-субъединице фолликулостимулирующего, лютеинизирующего и тиреотроп-
77
ного гормонов, а β-субъединица определяет его специфичность. Свободная
β-субъединица ХГЧ синтезируется в трофобласте, составляя в норме 0,5–3 % от
общего ХГЧ. Высокий уровень β-субъединицы ХГЧ определяется при синдро-
ме Дауна, преэклампсии (тяжелой форме позднего токсикоза с отеками, нару-
шением функции почек, артериальной гипертензией и поражением ЦНС).
Чувствительность биохимического скрининга беременных для анэнцефа-
лии достигает 98 %, для открытой спинномозговой грыжи — 90 %. Для синдрома Дауна чувствительность биохимического скрининга составляет 67–72 %
при 5–6 % ложноположительных результатов. Чувствительность скрининга по-
вышается, а число ложноположительных результатов снижается при комбини-
рованном подходе с учетом УЗИ-маркеров и некоторых других показателей.
Значительные отклонения маркерных белков от нормы в сочетании с нормальным кариотипом плода указывают на возможность развития плацентарной не-
достаточности и гипотрофии плода. Такие женщины нуждаются в дополнительном обследовании и проведении профилактики акушерской патологии.
2. Неинвазивные (просеивающее и уточняющее УЗИ, магнитно-резонанс-
ная томография, кардиомониторное исследование сердечной деятельности пло-
да с одновременной регистрацией его двигательной активности и тонуса матки). Просеивающие УЗИ, согласно приказу Минздрава России, должны прово-
диться всем беременным женщинам трехкратно: в 10–13, 20–22, 30–32 недели
беременности. Возможно использование УЗИ начиная с 6–8 недели. При пер-
вом УЗИ определяются точный срок беременности, размеры плода, наличие
грубых пороков развития. На этом сроке можно выявить анэнцефалию, отсутствие конечностей и другие грубые аномалии развития. Считается, что почти
все анатомические дефекты плода формируются уже к 18–22 неделям. Обсле-
дование на этом сроке в высшей степени ответственно. При обнаружении
врожденных пороков развития у плода беременная должна быть направлена
в медико-генетический центр, где работают высококвалифицированные специалисты. Данные УЗИ в 32–34 недели беременности имеют значение для тактики
ведения родов, указывая положение плода и т. д.
3. Инвазивные (амниоцентез, биопсия хориона, биопсия плаценты, кордоцентез, биопсия тканей плода и др.). Проводятся по строгим показаниям после проведения просеивающего УЗИ.
Для нескольких болезней уже разработаны не только теоретические основы диагностики (до развития клинической картины), но и методы профилактического лечения. Поскольку отдельные формы наследственных болезней редки
(распространенных генных болезней немного), для их выявления должны быть
простые и дешевые методы просеивающей диагностики. С их помощью можно
78
проводить идентификацию нераспознанных болезней с помощью быстро осуществляемых проверок (тестов). Это обеспечивает отбор лиц с вероятным заболеванием. Людей с высокой вероятностью заболевания повторно обследуют
с применением уточняющих диагностических методов, позволяющих либо отвергнуть предполагавшийся на первом этапе диагноз, либо уверенно подтвердить его. Идея просеивающего обследования новорожденных на унаследованную комбинацию аллелей, обусловливающую развитие наследственной болез-
ни, стала проверяться в 1960-х гг. К настоящему времени уже окончательно
сложились основные положения массовой диагностики наследственных болезней на доклинической стадии (критерии наследственных болезней и диагности-
ческие методы).
На сегодняшний день программы массового скрининга новорожденных
осуществляются в отношении фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза,
врожденной гиперплазии надпочечников, галактоземии и муковисцидоза. Ос-
новные цели этих программ — раннее выявление наследственного заболевания
на доклинической (досимптоматической) стадии и организация своевременного
профилактического лечения.
В стране создан Национальный генетический регистр, который является
общенациональной базой данных, предназначенной для регистрации и анализа
частоты и структуры врожденных и генетических заболеваний у новорожденных, а также для разработки профилактических рекомендаций по предупре-
ждению генетических нарушений на национальном уровне.
Медико-генетическое консультирование — вид специализированной
медицинской помощи, направленный на профилактику наиболее частой наследственной патологии в обществе. Начало становления медико-генетического
консультирования связано с деятельностью С.Н. Давиденкова. Главная цель
медико-генетического консультирования — предупреждение рождения детей
с тяжелыми наследственными заболеваниями.
Генетическая консультация выполняет следующие задачи:
1. Определение прогноза здоровья для будущего потомства в семьях, где
был, есть или предполагается больной с наследственной патологией.
2. Объяснение родителям в доступной форме смысла генетического риска
и помощь им в принятии решения по поводу деторождения.
3. Помощь врачам в постановке диагноза наследственной болезни, если
для этого требуются специальные методы исследования.
4. Диспансерное наблюдение и выявление группы повышенного риска
среди родственников индивида с наследственной болезнью.
5. Пропаганда медико-генетических знаний среди врачей и населения.
79
Поводом для медико-генетического консультирования могут быть:
– рождение ребенка с врожденными пороками развития, умственной
и физической отсталостью, слепотой и глухотой, судорогами, аномалиями по-
лового развития;
– повторные спонтанные аборты, выкидыши, мертворождения, выявление
патологии в ходе просеивающих программ;
– кровнородственные браки;
– неблагополучное течение беременности;
– воздействие известных или возможных тератогенных факторов в первые три месяца беременности.
Основной поток обращающихся в медико-генетические консультации
формируется по направлениям врачей разных специальностей, в первую оче-
редь педиатров.
Схема медико-генетического консультирования представлена на рис. 38.
Рис. 38. Схема медико-генетического консультирования.
Методология проведения медико-генетической консультации включает несколько этапов:
1. Клинико-генеалогическое обследование пациента и его родственников.
2. Получение оценок генетического риска.
80
На первом этапе консультирования производится уточнение диагноза
болезни. Диагноз уточняют с помощью генетического анализа, для чего используют генеалогический, цитогенетический, биохимический и другие методы
современной генетики.
На втором этапе определяется степень риска рождения больного ребен-
ка. Генетический риск может быть определен либо путем теоретических расчетов, основанных на генетических закономерностях, либо с помощью эмпирических данных. Определение степени риска при разных формах наследственной
патологии различно.
При моногенных менделирующих болезнях прогноз основывается на расчете вероятности появления потомства в соответствии с генетическими законо-
мерностями. При этом, если известен тип наследования данного заболевания
и по родословной удается установить генотип родителей, оценка риска сводит-
ся к анализу менделевского расщепления. Если у пробанда установлена вновь
возникшая мутация, то повторный риск рождения ребенка с такой же патологи-
ей незначителен. Расчет риска при моногенном заболевании может осложниться при пониженной экспрессивности или неполной пенетрантности гена, позд-
нем проявлении генетической аномалии, генетической гетерогенности заболе-
вания и вообще в случае неточного диагноза.
При хромосомных болезнях определение риска повторного рождения
потомства с хромосомными аномалиями зависит от того, нормальны ли карио-
типы у родителей, не обнаружено ли у них мозаицизма, не наблюдается ли семейной формы структурных аномалий хромосом. В случае отсутствия наруше-
ний в кариотипе родителей вероятность повторного рождения второго ребенка
с хромосомной аномалией оценивается по эмпирическим данным для каждого
вида аномалии с учетом возраста родителей.
При мультифакториальных заболеваниях, т. е. заболеваниях с наслед-
ственным предрасположением, основой оценки риска являются эмпирические
данные о популяционной и семейной частоте каждого из них.
При низком риске патологические изменения можно ожидать у 5 % по-
томков. В этой ситуации не возникает противопоказаний для дальнейшего деторождения. Средний риск регистрируется, если вероятность рождения больного ребенка составляет 6–20 %. В этом случае планирование деторождения зависит от тяжести предполагаемого заболевания и возможности дородовой
диагностики. Высокий генетический риск определяется в том случае, если ве-
роятность рождения ребенка с наследственной патологией составляет более
20 %. Такая оценка степени риска рождения больного ребенка достаточно
условна, так как немаловажную роль играет тяжесть наследственного заболева-
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]