Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие
.pdf
61
10. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД
Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе данных методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. В медицинской
генетике целями молекулярно-генетических методов являются диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также
выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации.
Преимуществом ДНК-диагностики является использование унифици-
рованного набора методов, практически не зависящего от целей проводимого
исследования. Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофореза, рестрикции
ДНК, гибридизации со специфическими ДНК-зондами и секвенирования. Таким образом, в пределах одной лаборатории можно заниматься ДНК-диагностикой широкого спектра заболеваний.
В зависимости от поставленных задач различают следующие виды
ДНК-диагностики:
– подтверждающая — проводится исследование ДНК больного человека
с целью определения непосредственной причины болезни;
– пресимптоматическая — исследуется ДНК клинически здоровых род-
ственников больного, как правило, при наследственных болезнях с поздней ма-
нифестацией (хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера);
– диагностика носительства — проводится здоровым родственникам
больных с рецессивными заболеваниями с целью планирования деторождения;
– пренатальная диагностика — поиск мутации, ответственной за болезнь
в семье;
– преимплантационная диагностика — исследование клеток эмбриона
в рамках процедуры ЭКО с целью отбора зародышей, не несущих мутантный ген.
В зависимости от методологии исследования выделяют косвенную и пря-
мую ДНК-диагностику. При косвенной ДНК-диагностике исследуют не непо-
средственную причину заболевания, а определяют наследование в семье участка хромосомы, несущей предположительно мутантный ген по аллелям генетических маркеров, лежащих в непосредственной близости от этого гена.
Точность данного типа диагностики составляет 95–99 %. На сегодняшний день
использование косвенной ДНК-диагностики становится редким, так как прак-
тически для всех наследственных заболеваний выявлена генетическая гетеро-
генность.
62
Прямая ДНК-диагностика направлена на поиск мутации, являющейся
непосредственной причиной болезни. Точность такой диагностики составляет
100 %.
Все методы начинаются с выделения из биологического материала ДНК
или РНК, которые в дальнейшем используют для анализа.
Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки.
Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэтому
такие образцы называют геномной ДНК.
На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хори-
он, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необ-
ходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нано-
граммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуются небольшое
количество биологического материала, например 1 мл крови, 5–10 мг культуры
клеток, 20–40 мг хориона, соскоб эпителия со слизистой оболочки щеки либо
несколько волосяных луковиц. Обработанную особым образом фракцию высо-
комолекулярных ДНК отделяют от низкомолекулярных соединений, таких как
фрагменты белков, липиды, углеводы, осаждают и отбирают ДНК, выпавшую
в осадок.
Полимеразная цепная реакция. ПЦР — это метод амплификации
(умножения) ДНК in vitro, позволяющий увеличить количество копий нужной
последовательности ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен
пар комплементарных нуклеотидов в количестве, превышающем исходное
в 10
6
и более раз. В основе реакции лежит механизм репликации молекул ДНК
ферментом ДНК-полимеразой. ПЦР изобретена в 1983 г. Кэри Муллисом. Для
проведения ПЦР нужно знать нуклеотидную последовательность амплифици-
руемого фрагмента. Схематическое изображение ПЦР представлено на рис. 25.
В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов 5’ и 3’ исследуемого участка синтезируются два олигонуклеотидных праймера (затравки)
(рис. 28).
Процесс амплификации состоит из повторяющихся циклов. Каждый
цикл включает три стадии:
I. Денатурация ДНК при температуре от 93 до 96 °С.
II. Гибридизация (отжиг) праймеров — присоединение праймеров к ком-
плементарным последовательностям одноцепочечных молекул ДНК (40–75 °С).
III. Элонгация — синтез комплементарных цепей ДНК Taq-полимеразой на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров
(60–75 °С).
63
Рис. 28. Схема полимеразной цепной реакции (М. Телков, 2006)
Реагенты для ПЦР:
1) исследуемая ДНК;
2) праймеры — олигонуклеотидные последовательности ДНК длиной от
15 до 30 п.н., комплементарные 3’-концам амплифицируемого участка на
смысловой и антисмысловой нитях ДНК (так как ДНК-полимераза способна
образовывать новую цепочку ДНК только в направлении от 5’-конца к 3’-концу, добавляя свободные нуклеотиды к 3’-концу собираемой цепочки) (рис. 29);
3) термофильная ДНК-полимераза (Taq-полимераза);
4) dNTP — набор дезоксинуклеотидтрифосафтов (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP), из которых Taq-полимераза выстраивает новые цепи ДНК;
5) буферный раствор, насыщенный ионами Mg2+;
6) деионизированная вода.
Общие рекомендации при выборе праймеров:
минимум вторичных структур;
содержание гуанина и цитозина 50–60 %;
64
повторы гуанина и цитозина не более 3 оснований подряд;
не помещать гуанин на 5’-конце;
не более двух гуанина и/или цитозина в пределах 5 крайних оснований
на 3’-конце.
Рис. 29. Расположение праймеров на ДНК-матрице
Чтобы исключить амплификацию других участков геномной ДНК, необ-
ходимо провести геномный поиск нуклеотидных последовательностей, которые
гомологичны заданной ДНК. Компьютерная программа для подбора праймеров — DNAStar.
Метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) основан на одновременной амплификации и количественном определении специфической ДНКпоследовательности.
Один из вариантов метода заключается в добавлении в смесь интеркали-
рующих красителей, при помощи которых затем определяют количество ДНК
в смеси. Флуорофор приобретает способность к свечению только после того,
как встраивается в ДНК-дуплекс. Чем больше синтезировано ПЦР-продукта,
тем более интенсивна флуоресценция, благодаря чему можно определить количество продукта амплификации и исходную концентрацию ДНК. Метод отли-
чается относительной простотой дизайна праймеров и дешевизной, но характеризуется низкой специфичностью.
Второй вариант метода (TaqMan) заключается в том, что флуорофор
начинает светиться при вытеснении его полимеразой в процессе амплификации. Метод отличается высокой специфичностью и дает возможность проводить мультиплексный анализ до пяти целевых генов в одной пробирке. Для
Real-Time PCR используются те же реагенты, что и для ПЦР, но дополнительно
добавляется интеркалирующий краситель SYBR Green (I вариант) или флуоресцентно меченные ДНК-зонды (II вариант).
65
Метод электрофореза в полиакриламидном и агарозном геле применя-
ется для разделения фрагментов ДНК в зависимости от длины или особенностей конформационной структуры. Используется для визуализации продуктов
реакции и выявления изменения нуклеотидной последовательности на основе
разности электрофоретической подвижности молекул в геле. Фрагменты ДНК
движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицатель-
ного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше отно-
сительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте
геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами. Визуализация и идентификация фрагментов
ДНК в геле становятся либо конечным этапом диагностики, либо элементом
дальнейшего анализа.
Идентификацию конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК
провести труднее. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции
образуется так много рестриктных фрагментов, что агарозный гель после элек-
трофореза и окраски этидия бромидом в ультрафиолетовых лучах выглядит более или менее равномерно окрашенным (рис. 30).
Рис. 30. Окраска бромистым этидием
Специфические фрагменты ДНК выявляют путем блот-гибридизации по
Саузерну (метод предложен в 1975 г. и сочетает агарозный электрофорез для
фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на
мембранный фильтр для гибридизации) (рис. 31). Саузерн-блот явился прообразом современных биочипов.
66
Рис. 31. Блот-гибридизации по Саузерну
Биочипы — это молекулы биополимеров, помещенные в многочислен-
ные правильно расположенные микроячейки на стекле, в микрокапли геля,
в микрокапилляры, или своеобразные «микролаборатории». Иммобилизованные зонды в ячейках избирательно связывают вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. При взаимодействии биочипа с исследуемым образцом,
предварительно обработанным флуоресцентным красителем, в ячейках проис-
ходит химическая реакция, и тогда эти ячейки начинают светиться — тем сильнее, чем интенсивнее процесс.
Заключительным этапом анализа мутаций является их секвенирование,
т. е. определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК.
67
Секвенированием называют процесс определения точного порядка рас-
положения нуклеотидов в молекуле ДНК. В 1976 г. А. Максам и В. Гилберт
разработали метод секвенирования, основанный на специфической химической
деградации фрагмента ДНК, меченного с одного конца (рис. 32). Основным
ограничением в секвенировании Максама — Гилберта стало использование
вредных химических веществ и таких методов, как рентгеновское излучение
и радиоактивные метки.
Рис. 32. Секвенирование Максама — Гилберта основано
на специфическом расщеплении цепочки ДНК с получением
различных меченых фрагментов ДНК по размеру
Секвенирование по Сэнгеру является одним из первых методов секвени-
рования ДНК. Фредерик Сэнгер вместе со своими коллегами начал свои иссле-
дования по разработке технологии секвенирования с инсулина, затем РНК, а затем и ДНК. Его исследования проложили путь к методу секвенирования, или
прерывания цепи Сэнгера, в 1977 г.
68
Исторически Сэнгер проводил секвенирование с использованием радиоизотопов. Суть метода заключалась в следующем: вначале ДНК денатурирова-
ли. Затем добавляли секвенирующий праймер, проводили отжиг праймера
и инициирование синтеза ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты — dATP, dCTP, dGTP, dTTP, один из ко-
торых радиоактивен. Синтез вели в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляли один из специфических дидезоксинуклеотидтри-
фосфатов, или терминаторов, — ddNTP. При встраивании ddNTP на место
соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращался. Таким образом, в каж-
дой из пробирок получали набор различающихся по длине радиоактивно меченных фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного элек-
трофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках
и радиоавтографии размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, определена и локализация ddNTP, и порядок соответствующих
им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК (рис. 33).
Рис. 33. Принцип секвенирования методом Сэнгера
69
На рис. 34 представлена идентификация нонсенс-мутации при помощи
секвенирования (исследование гена NF1): в области замены нуклеотида опре-
деляется дополнительный пик иного цвета, характерного для нуклеотида, на
который происходит замена.
Рис. 34. Выявление мутации методами SSCP и секвенирования
В 1980 г. Сэнгер получил свою вторую Нобелевскую премию по химии,
что сделало его одним из двух Нобелевских лауреатов, дважды получивших ее
в одной и той же категории. Технология была коммерциализирована компанией
Applied Biosystems. Это был метод, используемый для секвенирования всей че-
ловеческой ДНК в проекте «Геном человека» на базе сотен секвенаторов Sanger
во многих лабораториях мира. Секвенирование Сэнгера помогло исследовате-
лям определить мутации и первопричину генетических заболеваний. Это лучший метод для идентификации коротких тандемных повторов и секвенирова-
ния отдельных генов. Однако самым большим недостатком этого метода является количество времени, которое он потребляет, что связано с низкой
пропускной способностью. Метод может обрабатывать только относительно
короткие последовательности ДНК (до 300–1 000 пар оснований) одновременно.
Секвенирование Сэнгера используется в течение уже почти 30 лет после
его открытия. Стоимость и затраты времени в процессе данной процедуры ста-
ли осознаваться большой проблемой. Следующая волна технологий секвенирования, известная как секвенирование второго поколения, или секвенирование
следующего поколения (NGS), появилась в середине 2000-х гг. и была направлена на снижение затрат, увеличение скорости и устранение необходимости
в электрофорезе. Платформа Illumina/Solexa является детищем ученых Shankar
Balasubramanian и David Klenerman из Кембриджского университета, которые
внесли неоценимый вклад в первый проект генома человека. Оба они использо-
вали свой проект по флуоресцентно меченным красителям и синтезу компли-
ментарной цепи полимеразой для нового подхода к секвенированию, известно-
70
му как секвенирование путем синтеза. Платформа секвенирования с помощью
синтеза (SBS) Illumina/Solexa основана на методе реверсивной терминации
(reversible termination).
Секвенирование Illumina путем синтеза состоит из четырех основных
этапов: подготовки образца, генерации кластеров, секвенирования и анализа
данных. Одним из главных преимуществ технологии SBS является то, что со
стандартными реагентами она позволяет секвенировать до 96 образцов за цикл
работы. Одним из основных ограничений технологии SBS остается ограничение длины чтения, особенно когда речь идет о задачах расшифровки последо-
вательности de novo. Ошибки замещения из-за увеличения фонового шума
в каждом цикле, смещение GC в ходе мостиковой амплификации также вносят
известные ограничения данной технологии. К недостаткам можно отнести
и высокую стоимость приборов данной технологии.
Хотя технологии секвенирования второго поколения позволили секвенировать несколько геномов по сниженной цене, анализ больших структурных
изменений и секвенирование de novo остаются сложными задачами для данных
методов. Последующая стадия в секвенировании ДНК фокусируется на устранении необходимости амплификации ДНК и производства более длинных чтений в одном запуске. Однако данные технологии все еще находятся в стадии
исследований и разработок. Одномолекулярное секвенирование в реальном
времени (Single-molecule real-time sequencing (SMRT)) — это секвенирование
ДНК третьего поколения. Этот метод используется для прочтения относи-
тельно длинных участков последовательности ДНК и позволяет делать это
в режиме реального времени. Технология была разработана и запатентована
Pacific Biosciences of California, Inc. в 2011 г., и PacBio RS стал первым продук-
том, продаваемым на коммерческой основе.
Технология SMRT-секвенирования основана на наблюдении в реальном
времени за синтезом ДНК-полимеразой новой цепи на ДНК-матрице. Метод
одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT) позволяет
получать очень длинные чтения (в среднем около 20 000 нуклеотидов, до
60 000 нуклеотидов), что облегчает дальнейший анализ данных и позволяет избежать ряда проблем, возникающих при работе с короткими чтениями. Работает без предварительной амплификации исследуемой ДНК с помощью ПЦР.
Этот метод обеспечивает высокую скорость секвенирования (теоретически она
ограничивается только скоростью ДНК-полимеразы). Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью.
Технология секвенирования нанопор была исследована еще до того, как
были развиты технологии NGS-секвенирования. В начале 1990-х гг. David
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]