Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие
.pdf
11
1. ЧЕЛОВЕК КАК ОБЪЕКТ
ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В 1977 г. Фредерик Сэнгер разработал метод определения нуклеотидной
последовательности ДНК (секвенирования), который используется и по сей
день. В 1995 г. был расшифрован первый геном бактерии Haemophilis influenza,
в 1996 г. — геном эукариотической клетки (дрожжей Saccharomyces cerevisiae),
а в 1998 г. — геном нематоды Caenorhabditis elegans. В 1990 г. под руковод-
ством Джеймса Уотсона под эгидой Национальной организации здравоохране-
ния США был начат международный проект «Геном человека». В апреле 2022 г.
было сообщено, что международная команда исследователей секвенировала
последние 8 % генома человека и таким образом полностью его расшифровала.
Общебиологическое значение исследований в рамках проекта «Геном
человека» заключается в следующем:
– создание основы для нового направления в биологии — сравнительной
геномики. Исследования генома человека предшествовали секвенированию ге-
номов огромного числа других организмов, гораздо более простых; без геномного проекта эти данные были бы получены гораздо позже и в гораздо меньшем
объеме; расшифровка геномов организмов разных видов ведется все возрастающими темпами;
– углубленное изучение вопроса о соотношении кодирующих и некоди-
рующих областей в геноме («эгоистическая», или «мусорная» ДНК). Основная
доля «эгоистической» ДНК сохраняется в ходе эволюции и даже увеличивается,
т. е., вероятно, дает ее обладателю эволюционные преимущества.
Проект «Геном человека» имеет и непосредственное практические
значение в нескольких направлениях:
а) генодиагностике — идентификации новых генов и выявление среди
них обусловливающих предрасположенность к тем или иным заболеваниям;
б) генотерапии — лечении генетических заболеваний, редактировании
генома. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за многие болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера,
муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, хореей Гентингтона, наслед-
ственный рак молочной железы и яичников и др. Большинство обычных болезней современного общества, такие как рак, атеросклероз, нейропсихиатриче-
ские болезни, имеют существенный генетический компонент и также могут
рассматриваться как объекты классической генной терапии. В настоящее время
генная терапия внедряется и в область инфекционных заболеваний. Мишенью
12
генной терапии стали такие заболевания, как ВИЧ-инфекция, гепатит В, мононуклеоз, герпес и др. К 2000 г. в мире зарегистрировано 380 клинических протоколов генной терапии. Из них 68 % приходится на генную терапию злокачественных новообразований, 13,9 % — на моногенные наследственные заболевания, 8,2 % — на терапию инфекционных болезней.
В генотерапии используют два основных подхода, различающихся при-
родой клеток-мишеней, и, соответственно, выделяют два вида генной терапии.
Фетальная генотерапия — терапия, при которой генетическую кон-
струкцию вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития (введение
генов in utero). Ожидается, что введенный материал попадет во все клетки
реципиента. При эмбриональной генной терапии доставка терапевтического гена может быть осуществлена путем его введения в амниотическую полость.
Однако фетальная генотерапия пока недостаточно разработана для лечения
наследственных болезней человека. В то же время методы, разработанные
в экспериментах с эмбриональными клетками, могут быть использованы для
пренатальной диагностики наследственных заболеваний на ранней стадии
внутриутробного развития.
Соматическая генотерапия подразумевает введение генетического ма-
териала только в соматические клетки, и он при этом не передается половым
клеткам. При соматической генной терапии генетические конструкции могут
быть введены системно — in vivo (внутривенно, внутримышечно) и локально —
in situ (в сосуды, органы, опухоли), что наиболее предпочтительно и составляет
основу терапевтических протоколов. Если фетальная генотерапия пока неприемлема для лечения наследственных заболеваний человека, то соматическая
генная терапия уже используется в клинической практике.
Существуют три различных технологии (способа) введения терапевтиче-
ской генетической конструкции больному при соматической генной терапии: in
vivo, in situ и ex vivo:
1. Технология in vivo (системное введение через кровь) пока не реализо-
вана на практике. Это связано с затруднениями в разработке терапевтических
протоколов, вызванными множеством потенциальных тканей-мишеней (кожа,
мышцы, легкие, мозг, печень, клетки крови и т. д.). Многочисленность различ-
ных мишеней требует создания специфических и эффективных систем адрес-
ной доставки генетической конструкции.
2. Генная терапия in situ. Эта технология предполагает доставку генети-
ческих конструкций (чаще всего в составе вирусных векторов) локально, непо-
средственно в ткани организма (рис. 3).
13
Рис. 3. Использование аденовирусных векторов в генной терапии
Для данного способа введения необходимы два условия: первое заключа-
ется в том, чтобы клетки-мишени были легкодоступны, второе условие — что-
бы генетическая конструкция специфично проникала непосредственно в клет-
ки-мишени и экспрессировала терапевтический ген длительное время и на высоком уровне. Примерами генной терапии in situ служат генная терапия
муковисцидоза, основанная на локальном введении терапевтического гена в составе аденовирусного вектора в эпителий дыхательных путей; введение генноинженерных конструкций в массу опухоли в случае терапии злокачественных
новообразований.
Благодаря высокой эффективности и несложной методике получения век-
торы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди
разработчиков векторных систем. Эффективная генотерапия рака станет возможной при получении такого вектора, который мог бы онколитически воздействовать как на саму опухоль, так и на ее метастазы, находящиеся в разных
тканях организма. Этим требованиям отвечают споры клостридий. Другим пер-
спективным направлением в лечении злокачественных новообразований является генотерапия, основанная на применении наночастиц. В 2009 г. группа ученых под руководством доктора Э. Чанга представила наночастицы, являющиеся
сферами из молекул липидов, внутри которых находится полнофункциональная
14
копия гена опухолевого супрессора р53. Снаружи наночастицы покрыты анти-
телами, специфическими к белкам, типичным для раковых клеток. Это позво-
ляет обеспечить целевую доставку гена-онкосупрессора по кровотоку к клеткам
самой опухоли и ее метастазов.
3. Генная терапия ex vivo. Представляет собой технологию, основанную
на трансплантации (инфузии) собственных (аутологичных) клеток больного.
При этом подходе из организма изолируют клетки, вводят в них требуемую ге-
нетическую информацию и затем возвращают в тот же организм. Эти клетки
иммунная система не отторгает. Для реализации стратегии ex vivo в качестве
средств доставки генетической информации могут быть использованы аутоген-
ные первичные клетки (бластоциты). Первые эксперименты были проведены
с первичными астроцитами, которые были отобраны у взрослых доноров,
трансфецированы и затем помещены в ткани центральной нервной системы, где
эти клетки поддерживали длительную экспрессию введенного гена. Прекрас-
ными суррогатными клетками являются фибробласты, которые обладают спо-
собностью долго пролиферировать в культуре, не трансформируясь, легкодо-
ступны для отбора у доноров, полноценно поддерживают экспрессию встроен-
ных генов.
В последние годы проведены многочисленные эксперименты, направлен-
ные на применение фибробластов в генной терапии различных заболеваний.
Наиболее часто используются гематопоэтические стволовые клетки перифери-
ческой крови. Они обладают широкой пластичностью, легкодоступны для сбо-
ра и последующего возвращения в кровь. Первичная предопределенность их
к тем или иным органам (мозгу, миокарду) предполагает самостоятельный хо-
минг к необходимому органу.
Выделяют позитивную генную терапию, которая направлена на восста-
новление функции гена, экспрессия которого может быть недостаточной или
отсутствовать полностью. В большинстве случаев различные методы позитив-
ной генной терапии направлены на коррекцию поврежденного гена. Однако ча-
сто при инфекциях или опухолевой трансформации заболевание вызывается
избыточной функцией гена, несвойственной нормальной клетке. В таких случа-
ях генная терапия направлена на подавление сверхактивного гена или функции
«больного» гена путем введения в клетки генетических конструкций, экспрес-
сирующих факторы, которые тем или иным способом взаимодействуют с продуктом экспрессии нежелательного гена и нейтрализуют его вредный эффект.
В России широко реализуется программа создания препаратов для генной
терапии. Основные достижения связаны с разработкой лекарственных средств
15
для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, преимущественно на основе гена фактора VEGF165, вырабатывающего в клетках больного фактор роста эндотелиоцитов — вещество, стимулирующее рост сосудов. В 2008 г. в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗСР РФ»
проведены I и IIа фазы клинического исследования препарата «Корвиан»
у больных с критической ишемией нижних конечностей. «Корвиан» представляет собой суспензию плазмиды в физиологическом растворе. В доклинических
исследованиях было показано, что препарат стимулирует неоангиогенез и не-
токсичен. В случае получения положительных результатов испытаний I/IIa фаз
планируется применение препарата при других патологиях, связанных с нару-
шением трофики тканей.
В Новосибирском институте биоорганической химии разрабатываются
подходы к созданию на основе олигонуклеотидов ген-направленных биологи-
чески активных веществ и терапевтических препаратов, открывающих возмож-
ность инактивации геномов инфекционных агентов и избирательного подавле-
ния экспрессии генов, ответственных за злокачественное перерождение клетки.
Отдельным направлением является фармакогенетика, которая изучает
влияние особенностей строения ДНК на эффективность лечения. До 80 % побочных реакций связаны с генетическими особенностями пациентов, влияющими как на фармакодинамику, так и на фармакокинетику лекарственных
средств. Генетические особенности пациента, влияющие на фармакологический
ответ, чаще всего обусловлены так называемыми однонуклеотидными поли-
морфизмами, т. е. заменой одного нуклеотида на другой в последовательности
ДНК. Однонуклеотидные полиморфизмы могут изменять как фармакокинетику
(полиморфизм генов, кодирующих ферменты биотрансформации, белки-транспортеры лекарственных средств, принимающие участие в процессах всасывания, распределения и выведения), так и фармакодинамику (полиморфизм генов,
кодирующих молекулы-мишени лекарственных средств, белки, сопряженные
с молекулами-мишенями лекарственных средств).
Приоритетными направлениями в современной прикладной генетике
являются также:
– идентификация личности в судебной экспертизе, установление отцовства, опознание останков погибших;
– этногеномика — изучение генетических возможностей этноса, что востребовано в истории, лингвистике и других науках;
– палеогеномика — исследование древней ДНК, извлеченной из останков, найденных в могильниках и курганах с целью изучения биологических
16
процессов в эволюционном и историческом аспектах. В 2022 г. именно за от-
крытие в области палеогеномики была вручена Нобелевская премия по физио-
логии и медицине. Получил ее Сванте Паабо, которому удалось осуществить
секвенирование всего генома неандертальца, а также ДНК, извлеченной из
фрагмента кости, обнаруженной в Денисовой пещере на Алтае. Благодаря про-
веденным исследованиям команда Паабо сделала вывод о существовании около
40 тысяч лет назад денисовцев (Homo denisovensis).
23 сентября 2010 г. в Сиднее объявлено о запуске проекта, который является логичным продолжением проекта «Геном человека». Основные цели проекта «Протеом человека» — инвентаризация всех белков человека и выяснение
взаимодействий между ними. Цели российской части проекта — определение
протеома 18-й хромосомы человека на уровне чувствительности 1 копии белка
(пептида) на 1 мкл плазмы крови или на 106 клеток печени, выяснение путей
взаимодействия белков 18-й хромосомы человека со всеми остальными белка-
ми этих клеток (расшифровка интерактома) и создание базы данных. От реали-
зации проекта ждут разработки доступных каждому методов диагностики,
которые позволяют определять самые ранние стадии развития заболеваний; ин-
дивидуальных методов лечения заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми; создания новых методов биоинформатики и новых технологий в молекулярной биологии.
Даже за последние десятилетия в генетике человека произошли события,
которые ранее казались невозможными. Так, в 2002 г. родилась Ева — девочка,
клонированная из ДНК клетки кожи 31-летней американки. В медицинском
центре Пенн провели исследования, посвященные генетической терапии рака:
у трех пациентов взяли Т-лимфоциты, отредактировали их геном, наделив способностью уничтожать опухоли, а затем ввели обратно в организм испытуемых.
В 2019 г. в Китае родились «отредактированные» близнецы-клоны: ученые из-
менили геном девочек, сделав их устойчивыми к ВИЧ. Данные действия признали неэтичными и противозаконными, однако технически они оказались воз-
можными. В 2022 г. человеку пересадили сердце свиньи с отредактированным
геномом: в ДНК свиньи-донора были подавлены три гена, вызывающие оттор-
жение тканей животного иммунной системой человека, их заменили шестью
генами, помогающими органу прижиться. Экспериментальная операция заняла
семь часов и завершилась успешно. Спустя три дня после пересадки мужчина
чувствовал себя удовлетворительно, врачи не заметили признаков отторжения
трансплантата.
Однако, несмотря на достижения науки в данном направлении, в целом
человек как объект генетических исследований сложен. Это связано с суще-
17
ствованием ряда ограничений, возникающих при проведении экспериментов
в данной области науки:
– невозможно использовать основной метод генетики — гибридологический (невозможно скрещивать в искусственных условиях, что исключает возможность проведения прямых экспериментов);
– сложный кариотип — большое число хромосом в кариотипе: 2п — 46;
– большое число групп сцепления: у женщин — 23, у мужчин — 24, аутосомных — 22 и две по половым хромосомам;
– немногочисленное потомство, что затрудняет проведение статистического анализа. Человек — одноплодная особь (за одну беременность, как правило, рождается один ребенок), исключение — рождение близнецов;
– малое количество детей в браке;
– невозможность формировать необходимую схему брака, так как люди
свободно вступают в брак (в основе браков лежат любые мотивы, кроме научно-исследовательских целей);
– позднее половое созревание — продолжительность цикла развития до
наступления половой зрелости;
– редкая смена поколений — длительность существования одного поколения у человека составляет 25 лет;
– продолжительность жизни соизмерима с жизнью исследователя, одновременно можно наблюдать и проанализировать 3–4 поколения;
– невозможность создания одинаковых условий, среда для человека —
более широкое понятие, чем для животных и растений. Наряду с питанием,
климатом и другими абиотическими и биотическими факторами средой для че-
ловека являются и социальные факторы, трудно изменяемые по желанию ис-
следователя;
– характерен большой генотипический и фенотипический полиморфизм
(наличие в пределах одного вида отличающихся друг от друга особей).
С другой стороны, бурное развитие молекулярной биологии существенно
расширило наши представления о биохимических, физиологических, молекулярных и других важных процессах, происходящих в организме здорового че-
ловека, что позволяет судить о тонких патогенетических механизмах отдельных
клинических симптомов и заболеваний.
К достоинствам (преимуществам) человека как объекта генетических исследований можно отнести:
– исчерпывающие знания по анатомии и физиологии человека;
– большое число изученных мутаций, пополняемое и в настоящее время;
18
– многочисленность человеческой популяции в целом (позволяет всегда
выбрать нужную схему брака).
В качестве компенсации недостатков человека в генетических иссле-
дованиях можно отметить:
1) возможность выбора из популяции брачных пар, которые соответству-
ют целям генетического исследования;
2) в больших популяциях можно выбрать достаточное количество семей
с данным признаком для проведения статистического анализа;
3) возможность подбора и регистрации в течение длительного времени
семей с интересующими исследователя признаками; в некоторых семьях определенные признаки прослеживаются на протяжении многих поколений;
4) высокая степень изученности фенотипа человека методами анатомии,
физиологии, иммунологии, биохимии в клинике врачами всех специальностей;
6) разработка новейших методов работы с ДНК, методов гибридизации
соматических клеток человека и животных, что позволяет эффективно осу-
ществлять картирование человеческих хромосом, т. е. определять расположение генов в хромосомах.
В настоящее время выделяют следующие основные методы изучения
генетики человека:
1. Клинико-генеалогический метод.
2. Близнецовый метод.
3. Цитогенетический и молекулярно-цитогенетический методы.
5. Молекулярно-генетические методы.
6. Биохимические методы.
7. Популяционно-статистический метод и др.
19
2. КЛИНИКО-ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Метод был предложен в 1865 г. Ф. Гальтоном, однако как способ изуче-
ния наследственности человека его стали применять только с начала XX в.
Клинико-генеалогический метод дает возможность:
– выявлять наследственный характер признака;
– определять тип наследования;
– определять пенетрантность гена;
– изучать закономерности мутирования отдельных генов;
– устанавливать носительство мутантного гена тем или иным членом
семьи;
– определять вероятность генетически обусловленных событий и рассчитывать риск наследования патологического гена (признака) при медикогенетическом консультировании.
Клинико-генеалогический метод лежит в основе медико-генетического
консультирования и включает три этапа: сбор генетической информации, составление родословной, генетический анализ родословной.
Сбор генетической информации проводится путем опроса, анкетирования, личного собеседования. При составлении родословной сбор сведений
о семье начинается с человека, которого называют пробандом (обычно это
больной с изучаемым заболеванием или определенным признаком). Чем боль-
ше поколений удается проследить и чем более полон охват членов родословной
при сборе сведений, тем больше вероятность получения достоверных сведений
о характере наследования изучаемого признака. В родословную вносят сведе-
ния о выкидышах, абортах, мертворожденных, бесплодных браках, внебрачных
детях и пр.
При сборе информации необходимо внимательно анализировать сообще-
ния об инфекциях и травмах, следует учитывать гетерогенность и варьирую-
щую экспрессивность наследственных заболеваний. Следует выяснять акушер-
ский анамнез, учитывать наличие и характер профессиональных вредностей,
возраст, национальность, место жительства семьи, профессию, наличие хронических заболеваний в семье, причину смерти умерших и др.
На основании полученных данных составляется графическое изображе-
ние родословной. На рис. 4 изображены стандартные символы, применяемые
при составлении родословных (предложено в 1931 г. Г. Юстом).
20
Рис. 4. Символы, используемые при составлении родословных
При составлении графического изображения родословной важно со-
блюдать следующие правила:
1. Составление родословной начинают с пробанда. Братья и сестры (сиб-
сы) располагаются в порядке рождения слева направо, начиная со старшего.
2. Все члены родословной располагаются строго по поколениям, в один ряд.
3. Поколения обозначаются римскими цифрами слева от родословной
сверху вниз.
4. Арабскими цифрами нумеруется потомство одного поколения (одного
ряда) слева направо. Благодаря такой нумерации каждый член семьи имеет свой
шифр (например, I-1, I-2, II-2, II-4 и др.).
5. Указывается возраст членов семьи (родословной) в связи с тем, что не-
которые болезни проявляются в разные периоды жизни.
6. Отмечаются лично обследованные члены родословной.
Графическое изображение родословной может быть вертикально-гори-
зонтальным или расположенным по кругу (в случае многочисленных данных).
Схема родословной сопровождается описанием обозначений под рисунком (легендой).
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]