Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

08.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 136 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

хромосом используются такие программы, как Ikaros, KaryoFISH, видеотесты Карио 3.1 и Карио 3.0.

Рис. 23. Цветная исчерченность хромосом человека при M-FISH:

а — метафазная пластинка; б — раскладка хромосом

Определение половой принадлежности, а также своевременное выявле-

ние аномалий полового развития, наследования болезней, сцепленных с полом,

не только представляет огромный интерес для врачей разных специальностей,

но и востребовано в спорте и судебной медицине.

М. Барр и Ч. Бертрам (1949), изучая нейроны кошки, обратили внимание на то, что в интерфазном ядре клеток содержится интенсивно окрашиваемое

тельце, причем оно присутствует только в ядрах клеток самок и отсутствует

у самцов. Было замечено, что между числом телец полового хроматина и чис-

лом X-половых хромосом имеется прямая связь. Это тельце получило название полового хроматина, или тельца Барра. У ряда позвоночных и у человека оно

появляется в раннем онтогенезе на стадии гаструлы, но раньше развития половых желез. Половой хроматин в интерфазных ядрах обусловлен спирализацией

одной из Х-половых хромосом. На локализацию, форму и структуру полового

хроматина не влияют половые гормоны, следовательно, он не является вторичным половым признаком. Несколько исследователей одновременно высказали

предположение, что одна из Х-хромосом у нормальных женщин относительно

неактивна в генетическом отношении. В 1961 г. английская исследовательница М. Лайон выдвинула гипотезу о механизмах инактивации одной из Х-половых хромосом у женщин. Основные положения данной гипотезы следующие:

1. Одна из двух Х-хромосом клеток женщины неактивна. Неактивная

хромосома может быть отцовского или материнского организма.

2. Инактивация является механизмом, выравнивающим баланс генов по-

ловых хромосом в клетках мужчин и женщин.

3. Инактивация происходит в раннем эмбриогенезе и сохраняется во вре-

мя дальнейшего размножения и развития клеточной линии.

Если у женщин в ядре клетки несколько Х-половых хромосом, то и несколько телец Барра, активной остается лишь одна Х-хромосома. Х-хромосома

не вся инактивируется, часть короткого плеча остается генетически активной.

При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом.

Открытие глыбок гетерохроматина в интерфазных ядрах соматических клеток (телец Барра) позволило в дальнейшем использовать половой хроматин

для решения многих диагностических вопросов медицинской генетики. Перво-

начально для определения полового хроматина применяли биопсию кожи, но вскоре был описан метод исследования мазка слизистой оболочки ротовой по-

лости. Так, у женщин-спортсменок проводят половой контроль перед олимпий-

скими играми. Спортсменки, чей генетический пол не соответствует габитусу, имеющие морфологические признаки мужского соматотипа, имеют преимуще-

ство перед женщинами-спортсменками с женским кариотипом. Безусловно,

данный метод нашел применение и в медицине. Скрининговый тест, не требующий глобальных материальных затрат, применяется для быстрой диагностики количественных нарушений в половых хромосомах, таких как синдром Шере-

шевского — Тернера, Клайнфельтера, полисомии Х (табл. 2).

Таблица 2

Количество телец Барра при геномных мутациях

Кариотип

Синдром

Количество телец Барра

45, Х0

Шерешевского — Тернера

47, XХY

Клайнфельтера

47, XYY

Джейкобса

47, XХХ

Трисомии Х

48, XХХХ

Тетрасомии Х

Клетки, не содержащие половой хроматин (хроматин-отрицательные клетки), обнаруживаются у здоровых мужчин и у женщин, имеющих набор хромосом 45, Х0. Часто в ядрах клеток нормального мужского организма встречается несколько псевдотелец Барра (конденсированных участков аутосом) и спирализованных Y-хромосом, имеющих меньшие размеры. Поэтому при ди-

агностике различных хромосомных заболеваний необходимо уметь отличать

эти образования от истинного Х-полового хроматина.

Материал соскоба с внутренней поверхности щеки, полученный с помощью шпателя, переносится на предметное стекло и окрашивается 1 %-ным рас-

твором ацетоарсеина, накрывается покровным стеклом и изучается с помощью

светового микроскопа. Неактивная Х-хромосома выявляется в виде компактной

темной глыбки в интерфазном ядре соматических клеток нормальных женщин

и называется тельцем Барра, или половым Х-хроматином (рис. 24). При любом числе Х-хромосом в активном состоянии будет только одна, следовательно, половой Х-хроматин в норме выявляется только у женщин и отсутствует у мужчин.

Рис. 24. Наличие (справа) и отсутствие (слева) полового хроматина

в ядрах клеток женщины и мужчины

Основные показания для проведения цитогенетической диагностики:

1. Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у мужчин

и женщин.

2. Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития.

3. Задержка умственного и физического развития ребенка.

4. Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике.

5. Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной неста-

бильностью.

6. Гемобластозы и онкологические заболевания.

7. Пренатальная и преимплантационная диагностика в супружеских парах

повышенного генетического риска.

8. Оценка мутагенных воздействий.

8. МЕТОДЫ ГЕНЕТИКИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Методы генетики соматических клеток в значительной мере компенси-

руют невозможность применения к человеку метода гибридологического анализа. Методы генетики соматических клеток, основанные на размножении этих клеток в искусственных условиях, позволяют не только анализировать генети-

ческие процессы в отдельных клетках организма, но и благодаря полноценно-

сти наследственного материала, заключенного в них, использовать их для изу-

чения генетических закономерностей целостного организма.

Соматические клетки обладают свойствами, делающими их удобным

объектом генетических исследований:

– они могут быстро размножаться на искусственных питательных средах;

– из одной клетки путем клонирования можно получить генетически однородное потомство;

– генетически различные клетки могут сливаться и давать начало гибридным клонам;

– можно получить любое количество биомассы клеток для биохимического исследования;

– культивируемые клетки могут быть подвергнуты цитохимическому исследованию.

Соматические клетки человека могут сливаться с соматическими клетка-

ми другого человека или с клетками других видов млекопитающих (мышей, крыс, морских свинок, обезьян и др.). Образующиеся при этом клетки называ-

ются гибридными. В гибридных клетках ядра вначале не сливаются (гетерокарион), а затем могут сливаться (синкарион). При этом в ядре оказываются два набора хромосом. Во время повторных митозов гибридной клетки хромосомы

одного вида постепенно элиминируются (теряются), а другого — сохраняются.

Например, при гибридизации соматических клеток человека и мыши теряются хромосомы человека, а в гибридных клетках человека и крысы элиминируются

хромосомы крысы.

Постепенная потеря хромосом человека из гибридных клеток параллельно с изучением ферментов позволяет судить о локализации гена, контролиру-

ющего синтез того или иного фермента в определенной хромосоме.

С помощью метода гибридизации соматических клеток определяют лока-

лизацию генов в хромосомах человека, а также сцепление генов. Таким обра-

зом, например, был картирован ген тами-динкиназы (в 17 хромосоме) — фер-

мент, от которого зависит ощущение человеком вкуса фенилтиомочевины

(ФТМ).

Существуют следующие методы генетики соматических клеток че-

ловека:

– простое культивирование — использование культуры клеток различных тканей и органов для изучения наследственности и изменчивости соматических клеток;

– клонирование — получение потомков одной клетки, например, гибридом. Гибридома — это клеточный гибрид, полученный путем слияния нор-

мального лимфоцита и опухолевой клетки, способный производить монокло-

нальные антитела одного типа (рис. 25);

– селекция — отбор клеток с заранее заданными свойствами;

– гибридизация. Для гибридизации могут использоваться клетки от раз-

ных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской

свинки и др.). Гибридные клетки при делении обычно «теряют» хромосомы одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек — мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек — крыса» сохра-

няются все хромосомы человека и одна хромосома крысы. Таким образом,

можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность

изучать сцепление генов и их локализацию, изучать механизмы первичного

действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности.

Рис. 25. Получение моноклональных антител

Методы генетики соматических клеток основаны на том, что соматиче-

ские клетки быстро размножаются на питательной среде, они успешно клони-

руются, могут сливаться и образовывать гибридные клоны, давая идентичное

потомство. Соматические клетки подвергаются селекционному отбору на пита-

тельных средах и могут долго сохраняться при глубоком замораживании. Ме-

тоды генетики соматических клеток дают возможность судить о генетической

гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на молекуляр-

ном и клеточном уровнях.

9. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ

Генетическая карта — схема расположения структурных генов и регу- ляторных элементов, а также генетических маркеров в хромосоме (рис. 26).

Рис. 26. Генетические карты 7, 8, 9 и 10-й хромосом человека

При создании генетической карты устанавливают последовательности расположения генетических маркеров по длине всех хромосом с определенной

плотностью, т. е. на достаточно близком расстоянии друг от друга. Генетические карты могут быть сопоставлены с цитологическими или цитогенетическими картами и широко используются в медицине при диагностике ряда тяжелых наследственных заболеваний (рис. 27).

В основе картирования генов лежат хорошо известные биологические явления: сцепление генов, их рекомбинация во время мейоза и полиморфность генома. Благодаря сцеплению мутация, детерминирующая болезнь, передается потомкам вместе с блоком окружающих ее аллелей соседних локусов. Рекомбинация в ряду поколений уменьшает размер этих блоков. Чем ближе расположены два локуса, тем дольше их аллели сохраняются в одном блоке. Идентификация блоков, полученных от различных родителей, обеспечивается полиморфностью генома, многие локусы которого имеют не один, а несколько вариантов нуклеотидных последовательностей. Такие локусы служат генетиче-

скими маркерами. Для того чтобы картировать ген, вызывающий болезнь, достаточно доказать совместную сегрегацию болезни и блока маркерных аллелей.

Рис. 27. Генетические карты 3 и Х-хромосомы человека

Существует два методических подхода, позволяющих выявить те блоки маркерных аллеей, которые сегрегируют вместе с комплексной болезнью: ана-

лиз сцепления и анализ ассоциаций.

Основная идея анализа сцепления, или рекомбинационного анализа, заключается в поиске блока маркеров, которые передаются от больного родителя преимущественно больным потомкам и не передаются здоровым. В разных семьях аллельный состав таких блоков может различаться, но их позиция в геноме должна быть одинакова. Информативными для анализа сцепления являются только гетерозиготные маркерные локусы. Поэтому предпочтительными для анализа являются полиморфные маркеры, имеющие много аллелей. Материалом для анализа сцепления всегда служат родственники: это могут быть пары

больных сибсов или расширенные родословные.

Самыми мощными считаются методы, базирующиеся на известной моде-

ли наследования признака, которая включает оценку популяционной частоты

мутантного аллеля и пенетрантности генотипов. Однако установление модели

наследования для комплексных болезней — достаточно сложная задача. Вследствие данных трудностей, а также поскольку искажение модели наследования

приводит к потере мощности, более популярными являются статистические методы, свободные от модели наследования. В их основе лежит анализ идентич-

ности по происхождению маркерных аллелей у пар больных родственников.

Второй метод картирования — анализ ассоциаций, или неравновесия по

сцеплению. Неравновесие по сцеплению между двумя аллелями разных локусов выражается в том, что частота их совместной встречи в популяции отличается от ожидаемой при случайной независимой встрече. Одной из основных, хотя и не единственной, причиной существования неравновесия по сцеплению

в популяции является тесное сцепление. Например, если в момент возникнове-

ния мутации, вызывающей болезнь, рядом находился определенный маркерный аллель, то в течение многих поколений этот аллель будет передаваться вместе с

мутацией. Рекомбинация постепенно разрушает ассоциацию, и происходит это тем быстрее, чем дальше друг от друга расположены локусы.

Основная идея картирования с помощью анализа ассоциаций заключается в следующем. Если у большинства больных в популяции мутантный аллель имеет общее происхождение, окружающие маркеры находятся с ним в неравновесии по сцеплению. Для локализации гена, контролирующего болезнь, надо найти такой маркер, один из аллелей которого преобладает у больных. В отли-

чие от анализа сцепления, здесь предполагается, что у больных из разных семей

этот маркер не только имеет одинаковую локализацию в геноме, но и содержит

один и тот же аллель. Поэтому при анализе ассоциаций не надо исследовать ро-

дословные, материалом для этого анализа могут служить независимые группы

больных и здоровых людей.

Существуют два основных подхода к картированию генов комплексных

признаков: изучение генов-кандидатов и позиционное клонирование, также называемое сканированием генома. Ключевым моментом при применении стратегии изучения генов-кандидатов является их выбор, который осуществляется

на основе знаний о биологии признака. Как правило, такие знания получаются при изучении модельных объектов. Идеальными свойствами модельного объекта являются короткий жизненный цикл, возможность проведения направленных скрещиваний и других биологических манипуляций, а также адекватность мо-

делируемой системе.

Одним из наиболее известных успехов применения стратегии генов-

кандидатов в популяциях человека было изучение гена, кодирующего ангиотен-

зиноген (AGT, OMIM *106150). Роль ренин-ангиотензиновой системы в контроле давления крови была установлена уже в 1970-е гг. при изучении модельных объектов. В 1980-е гг. была охарактеризована структура человеческого гена AGT и установлена его позиция в геноме. В 1992 г. Jeunemaitre et al. (1992) на

примере 379 пар сибсов с повышенным давлением показали, что регион, со-

держащий AGT, сцеплен с этим признаком. В процессе секвенирования AGT они нашли 15 полиморфизмов и обнаружили, что два из них ассоциированы

с повышенным давлением. В последующие годы было проведено несколько десятков исследований ассоциации и сцепления AGT с повышенным давлением

крови и другими сердечно-сосудистыми патологиями. В настоящее время мо-

жет считаться установленным, что некоторые полиморфизмы в гене AGT свя-

заны с различными заболеваниями сердца и сосудов.

Позиционное клонирование не предполагает использования априорных

знаний о генетике признака: каждый участок генома последовательно тестируется на участие в контроле признака. Этот процесс называют сканированием генома. Он позволяет идентифицировать новые гены и расширять наши знания о биологии признака. Сканирование генома можно проводить как с помощью

анализа сцепления, так и с помощью анализа ассоциаций. Основными проблемами стратегии геномного сканирования в настоящее время являются огромная

вычислительная сложность этой задачи, связанная с этим относительно слабая

разработанность методологии и отсутствие пакетов прикладных программ.

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 136 7 8 9 10 11 12 13 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]