Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие
.pdf
31
пользуясь индексом физического развития, основанным на соотношении роста,
массы тела и окружности грудной клетки, выделил три основных типа: асте-
нический, нормостенический и гиперстенический.
При астеническом типе телосложения отмечается преобладание длины
конечностей над длиной туловища, грудной клетки над животом, а в целом
продольных размеров над поперечными. У гиперстеников отмечаются преиму-
щественный рост тела в ширину и его массивность, при этом при относительно
длинном туловище короткие конечности, преобладают значительные размеры
головы, груди и живота. Нормостеники занимают, по автору, промежуточное
положение между двумя описанными выше типами телосложения.
Для гиперстеников характерны высокое стояние диафрагмы, горизонтальное расположение сердца, короткие, широкие легкие, гиперсекреция надпочечников, высокое содержание в крови гемоглобина и эритроцитов. В связи
с этим замечено, что лица гиперстенического типа конституции более предрасположены к болезням обмена веществ, подагре, заболеваниям желчных путей,
атеросклерозу. У людей атлетического телосложения (нормостеников) все показатели в пределах средних величин, однако они чаще страдают ревматизмом,
язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Астеники часто
страдают артериальной гипотонией, неврозами, гастритом с пониженной кис-
лотностью, более склонны к развитию туберкулеза легких. У них обычно более
длинные легкие, малое сердце, высокий обмен веществ, повышенные функции
гипофиза, щитовидной и половых желез, пониженная функция надпочечников,
склонность к смещению органов вниз.
32
6. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД
Биохимические методы в изучении генетики человека используются для
диагностики наследственных болезней обмена веществ (НБО). Они направлены
на выявление аномальных белковых продуктов генов или патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях пациента. Объектами
биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови,
форменные элементы крови, другие биологические среды организма. Предме-
том биохимической диагностики могут быть различные классы органических
и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в ак-
тивности ферментов.
Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные
и полуколичественные. Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их
производных. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, от-
личаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов.
Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой,
так и с кровью (концентрация газов крови, общего белка, глюкозы, ионов аммония, молочной кислоты, кетоновых тел, пировиноградной кислоты, холестерина, триглицеридов) и могут иметь различную степень сложности. Наибо-
лее простые из них: измерение концентрации лактата, пирувата, кетоновых
тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия.
Решающее значение в диагностике нарушений обмена играют более сложные
и высокоточные количественные методы, такие как флуориметрия, хроматография, спектрофотометрия, различные виды хроматографии и электрофорез.
Одним из наиболее современных методов анализа является тандемная
масс-спектрометрия. Это аналитический метод, с помощью которого можно
получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная
масса или концентрация) информацию анализируемых молекул после их пре-
образования в ионы. В 1993 г. Дональд Чейз с коллегами адаптировал этот метод для анализа аминокислот в высушенных пятнах крови, сформировав таким
образом основу для скрининга множества компонентов при наследственных
болезнях обмена веществ. В дальнейшем метод был адаптирован для проведе-
ния крупномасштабных анализов, необходимых для неонатального скрининга.
33
Биохимический метод играет важную роль для диагностики моноген-
ных болезней обмена веществ, при которых определяют изменения уровня спе-
цифических показателей в крови:
галактоземия — определяют концентрацию галактозы;
тирозинемия — тирозина и фенилаланина;
гомоцистинурия — гомоцистеина и метионина;
алкаптонурия — гомогентезиновой кислоты;
болезнь Леша — Нихена — мочевой кислоты;
адреногенитальный синдром — 17-альфа-оксипрогестерона;
митохондриальные болезни — молочной и пировиноградной кислот;
синдром Рефсума — фитановой кислоты;
болезнь Вильсона — Коновалова — меди, церулоплазмина.
Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохи-
мические методы. Иммуногистохимический метод применяется для выявле-
ния белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфических анти-
тел (именно так проводят дифференциальную диагностику прогрессирующих
мышечных дистрофий и прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна —
Беккера). Иммуногенетическое тестирование позволяет поставить или уточнить
диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на
антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп
крови.
В Медико-генетическом научном центре РАМН разработана программа
селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ с острым
течением и ранним летальным исходом. Первый этап программы включает
14 качественных и количественных тестов с мочой и кровью на белок, на кетокислоты, на цистин и гомоцистеин, креатинин, ионы аммония и др. Второй этап
включает методы тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления
аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и других соединений.
С помощью электрофореза мочи определяют наличие гликозаминогликанов.
34
7. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД
Одной из основных фундаментальных задач современной медицинской
генетики является изучение закономерностей строения и функционирования
материальных носителей наследственной информации — хромосом человека —
в норме и при патологии.
Хромосомы как «окрашивающиеся тела» были открыты в митотически
и мейотически делящихся клетках классиками цитологии Флеммингом и Страс-
бургером (W. Flemming, 1882; E. Strasburger, 1884). Свое название хромосомы
получили благодаря способности интенсивно окрашиваться основными краси-
телями. Термин «хромосома» был предложен в 1888 г. W. Waldeyer. Хромосома
образуется из единственной и чрезвычайно длинной молекулы ДНК, которая
содержит множество генов. Комплекс белков, связанных с ДНК, образует хро-
матин. Строение хромосомы лучше всего видно в метафазе митоза. Она пред-
ставляет собой палочковидную структуру и состоит из двух сестринских хроматид, удерживаемых центромерой в области первичной перетяжки (рис. 6).
Рис. 6. Строение метафазной хромосомы
Наиболее ценную информацию о тонкой структуре функционирующих
хромосом принесло исследование гигантских политенных хромосом (от poly —
много и лат. taenia — повязка, лента), которые являются специфической, но
естественной моделью хромосом интерфазного ядра. Политенные (многонитча-
35
тые) хромосомы впервые описаны французским цитологом Э. Бальбиани в 1881 г.
Они являются результатом многократных репликаций хромосом без последу-
ющего деления клетки или ее ядра (эндомитоза). Политенные хромосомы пред-
ставляют собой пучки из нескольких тысяч параллельно расположенных хроматид, каждая из них соответствует интерфазной хромосоме с характерным рисунком чередования компактных хроматиновых структур (хромомеров) и менее
плотных межхромомеров. Поскольку хроматиды располагаются в одном поряд-
ке, эти рисунки совпадают, что приводит к образованию дисков и междисков
и определяет поперечную исчерченность политенных хромосом (рис. 7).
Рис. 7. Политенные хромосомы
Наука, занимающаяся изучением функционирования хромосом на всех
уровнях их организации (микроскопическом, субмикроскопическом, молеку-
лярном), называется цитогенетикой. Среди многих методов изучения наслед-
ственной патологии человека цитогенетический метод занимает важное место.
С помощью цитогенетического исследования в генетике человека можно про-
вести анализ кариотипа в норме и патологии, изучить закономерности мутаци-
онного и эволюционного процессов. Все хромосомные болезни у человека бы-
ли открыты с помощью цитогенетического метода.
Развитие современной цитогенетики человека связано с именами Д. Тио
и А. Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 хромосом
36
(рис. 8), что положило начало широкому изучению митотических и мейотиче-
ских хромосом человека.
Рис. 8. Нормальный кариотип человека
Рис. 9. Кариотип человека с синдромом Дауна
37
В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р. Тюрпен и М. Готье установили хромосомную природу болезни Дауна (рис. 9). Классификация и номенкла-
тура равномерно окрашенных хромосом человека впервые были приняты на
международном совещании в 1960 г. в Денвере, США, в дальнейшем несколько
измененные и дополненные (Лондон, 1963, и Чикаго, 1966).
Согласно Денверской классификации все хромосомы человека разделе-
ны на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины и с учетом цен-
тромерного индекса (отношения длины короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженного в процентах). Группы обозначаются буквами английского
алфавита от А до G. Все пары хромосом принято нумеровать арабскими цифрами, выделены отдельно и поименованы латинскими буквами Х и Y половые
хромосомы (рис. 10).
Рис. 10. Денверская классификация хромосом
Анализ кариотипа человека проводят в культуре лимфоцитов периферической крови, кожных фибробластов, клеток костного мозга, а также половых
клеток. Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической
крови, которые в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического
анализа у человека в постнатальном периоде. Для исследования кариотипа
человека достаточно получить образец периферической крови в количестве
1–2 мл. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы клетки ворсин
38
хориона (9–11 неделя внутриутробного развития), в более позднем сроке цито-
генетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амнио-
тической жидкости (амниоцентез с 12 по 19 неделю), пуповинной крови (кордоцентез — пункция сосудов пуповины для получения крови плода в сроки
с 20 недели) и плаценты.
Цитогенетический анализ включает три основных этапа: культивирование клеток, окраску препарата, микроскопический анализ препарата.
После взятия образец крови помещают в питательную солевую среду
с добавлением фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток.
Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания
культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное
веретено, и процесс деления останавливается на стадии метафазы. Обычно продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки
с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор
хлорида калия или цитрата натрия, что приводит к разрыву ядерной оболочки
и межхромосомных связей и свободному перемещению хромосом в цитоплазме.
После фиксируют клетки смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего клеточную суспензию раскапывают на охлажденные
влажные предметные стекла и высушивают на воздухе. В зависимости от целей
исследования, т. е. от того, какой именно тип перестроек необходимо выявить,
можно использовать различные виды окрашивания. После окрашивания препараты анализируются, и производится раскладывание хромосом по порядку,
определяемому международной классификацией, т. е. производят построение
кариограммы пациента. Принцип упорядоченности общий для всего вида
и определяется идиограммой. Идиограмма — это графическое изображение
гаплоидного набора хромосом (можно и диплоидного) и расположение их по
группам в зависимости от формы и величины (рис. 11).
В медико-генетической практике используется световая микроскопия
(главным образом в проходящем свете), в том числе люминесцентная микро-
скопия. Для адекватного выявления хромосомных аномалий необходимо про-
анализировать не менее 30 метафазных пластинок. Цитогенетики в своей повседневной работе сравнивают образцы со стандартами, полученными при изу-
чении нормальных кариотипов человека.
При кариотипировании чаще всего используют окраску по Гимзе — простую, или рутинную, окраску, при которой все хромосомы равномерно окрашиваются по всей длине. При рутинной окраске хромосом возможна только их
групповая идентификация, поэтому данный метод используется для ориентиро-
вочного определения числовых аномалий кариотипа.
39
Рис. 11. Идиограмма хромосом человека
Структурные хромосомные аномалии (делеции, транслокации, инверсии),
выявляемые при рутинной окраске, должны быть идентифицированы с помо-
щью дифференциального окрашивания. В основу Парижской классификации
(1971) положено дифференциальное окрашивание хромосом, когда каждой паре
присущ характерный только для нее порядок чередования темных и светлых
полос — участков гетерохроматина и эухроматина, и предложена система их
обозначения. На данный момент разработаны четыре основных метода диф-
ференциального окрашивания, или бэндинга, которые позволили выявить
в каждой хромосоме любого вида специфическое чередование различно окра-
шенных (светлых и темных) полос: Q, G, R, и С-окрашивание (рис. 12).
G-окрашивание хромосом — самый распространенный метод в клинико-
цитогенетической практике, базируется на предварительной обработке препаратов хромосом перед окраской и на использовании нефлуоресцентных краси-
телей или их смесей типа Романовского — Гимзы. Предварительная (постфик-
40
сационная) обработка связана с инкубацией в солевых растворах и в растворах
протеолитических ферментов (трипсина, различных протеаз) при определенных
температуре и рН.
Рис. 12. Методики окраски хромосом
Идентификацию хромосом обеспечивает чередование темно и светло
окрашенных полос. Темные полосы (G-полосы, G-бэнды) образуются в местах
локализации интерстициального гетерохроматина (рис. 13). Число полос на кариотип при G-окрашивании варьируется, но в метафазной клетке их число не
менее 320, а на стадии прометафазы может достигать и 1 250 на гаплоидный
набор. Этот способ окрашивания позволяет идентифицировать хромосомы, вы-
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]