Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Современные методы изучения генетики человека. Учебное пособие
.pdf
41
являть делеции, инверсии, инсерции, транслокации, ломкие участки и более
сложные перестройки.
Рис. 13. G-окрашивание:
темные полосы — гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся,
богатые А-Т; светлые полосы — эухроматиновые, рано реплицирующиеся,
богатые Г-Ц
Q-окрашивание хромосом. При этом типе окрашивания хромосомы об-
рабатывают различными флуорохромами и анализируют их с помощью флуоресцентной микроскопии. Из флуорохромов чаще всего применяют производные акридина: акрихин (атебрин) и акрихин-иприт. Рисунок каждой хромосомы
специфичен по числу, положению и размеру полос по-разному светящихся сегментов, что обеспечивает идентификацию всех хромосом (рис. 14). Стабильность рисунка определяется степенью конденсации хромосом, так как в прометафазных (длинных) хромосомах крупные однородные полосы разделены на
более мелкие. Однако существует истинная вариабельность Q-рисунка, которая
определяется выраженностью ярко светящихся сегментов хромосом 3, 4, 13–15,
21, 22 и Y. Самый крупный ярко светящийся сегмент проявляется в хромосоме Y. Он хорошо виден в интерфазных клетках разных тканей и может служить
цитологическим показателем пола индивидуума.
При С-окрашивании в хромосомах определяются лишь центромерные
и околоцентромерные районы хромосом и длинное плечо хромосомы Y
(рис. 15). Смысл этого метода в том, что он выявляет структурный гетерохро-
42
матин во всех хромосомах и тем самым позволяет оценить хромосомный полиморфизм, а также уточнить характер хромосомных перестроек, особенно при
идентификации перицентрических инверсий.
Рис. 14. Митотические хромосомы человека, окрашенные по Q-методу
Рис. 15. Митотические хромосомы человека, окрашенные по С-методу
Рисунок при R-окрашивании противоположен рисунку G-окрашивания:
R-положительные полосы соответствуют G-отрицательным, и наоборот, Rотрицательные сегменты соответствуют G-положительным (рис. 16). Интенсивность окраски всех хромосом при этом методе обычно значительно слабее,
43
чем при G-окрашивании, поэтому исследователям рекомендуют проводить
микроскопию под фазовым контрастом. При модификации этого метода можно
добиться так называемой Т-окраски, когда более активно выделяются теломер-
ные районы при интенсивном окрашивании по Романовскому — Гимзе. В настоящее время метод R-окрашивания довольно редко используется в клинической практике отдельных лабораторий для уточнения хромосомных аномалий
в спорных случаях после G-окрашивания.
Рис. 16. R-окрашивание:
темные участки — эухроматиновые; светлые участки — гетерохроматиновые
Кариотип человека состоит из 46 хромосом, что было точно определено
в 1956 г. До открытия дифференциальной окраски хромосомы классифицировались по общей длине и своему центромерному индексу, который представля-
ет собой отношение длины короткого плеча хромосомы к ее общей длине.
В кариотипе человека были найдены метацентрические, субметацентрические
и акроцентрические хромосомы. Также были идентифицированы половые хро-
мосомы. Позже использование методов дифференциальной окраски позволило
идентифицировать все хромосомы кариотипа человека. В 1970-х гг. были раз-
работаны правила (стандарт) их описания и обозначения. Так аутосомы дели-
лись на обозначаемые буквами группы, к каждой из которых относились хромосомы с определенным номером: A (1–3), B (4, 5), C (6–12), D (13–15),
E (16–18), F (19, 20), G (21, 22). Половые хромосомы являются 23-й парой.
Нормальный кариотип человека записывается так: 46, XX — для женщины,
46, XY — для мужчины.
44
Согласно рекомендациям IV Международного конгресса по генетике че-
ловека (Париж, 1971), при описании геномных мутаций номер добавочных
хромосом помещают после общего числа аутосом и половых хромосом со зна-
ками «плюс» или «минус». Например, запись 47, ХХ + 21 обозначает кариотип
с трисомией по 21 паре хромосом у женщины. При описании хромосомных мутаций знаки «плюс» или «минус» ставят после номера хромосомы, чтобы указать удлинение или укорочение ее плеча. Буква q символизирует длинное плечо, а p — короткое (табл. 1).
Таблица 1
Обозначение мутаций кариотипа человека
Символическая запись
Тип мутации
Синдром
46, ХY, 1q+
dup (дупликация) длинного
плеча хромосомы 1
Нежизнеспособен
46, ХY, 15t21+
t (транслокация)
Дауна
46, XY, 5р–
del (делеция) короткого
плеча хромосомы 5
«Кошачьего крика»
Сокращения dup (дупликация), del (делеция), inv (инверсия), r (кольцевидная хромосома) и t (транслокация) обозначают хромосомные аберрации.
Номера хромосомы помещают после сокращений в скобках. Например, запись
46, ХХ, r(18) обозначает, что кариотип женщины с 46 хромосомами включает
r-хромосому 18. Запись 46, ХY, 1q+ указывает на увеличение длинного плеча
хромосомы 1 мужчины. Формула 47, ХY + 14р+ указывает на кариотип мужчины с 47 хромосомами, включая и дополнительную хромосому 14 и удлинение
ее короткого плеча. Чаще при изучении хромосом обнаруживают полимор-
физм, который характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, от-
ражает вариабельность коротких плеч, размеров гетерохроматиновых сегмен-
тов, наличие спутников и их величину. Примеры:
1) 46, ХХ, 1qh+. Увеличение размера гетерохроматинового участка в длин-
ном плече хромосомы 1 женщины (h — heterochromatine) (рис. 17);
2) 46, XY, Yqh–. Уменьшение размера гетерохроматинового района на
длинном плече Y-хромосомы у мужчины (рис. 18);
3) 46, XY, 21ps+. Увеличение размера спутников на коротком плече хро-
мосомы 21 у мужчины (рис. 19).
45
Рис. 17. Женский кариотип, увеличение длины гетерохроматинового района
в длинном плече хромосомы 1 (46, ХХ, 1qh+)
Рис. 18. Мужской кариотип, уменьшение размера
гетерохроматинового района на длинном плече Y-хромосомы
46
Рис. 19. Мужской кариотип, увеличение размера спутников
на коротком плече хромосомы 21
Установлено, что среди супружеских пар, у которых наблюдалось рожде-
ние детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным
невынашиванием беременности, чаще обнаруживается носительство хромосом
с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также
в хромосомах 1, 9 и 16 наблюдается у детей с врожденными пороками развития.
Последние успехи цитогенетики человека позволили разработать новые
высокоинформативные методы изучения хромосом. Среди них в первую оче-
редь следует назвать метод флуоресцентной гибридизации in situ, или так называемый FISH-метод. FISH-метод позволяет выявлять индивидуальные хромо-
сомы и их отдельные участки на метафазных пластинках или интерфазных ядрах (деконденсированные хромосомы, без четкой морфологической структуры)
на основе особенностей их молекулярно-генетического строения. С помощью
этого метода не только идентифицируются индивидуальные хромосомы или
отдельные гены, но и расшифровываются сложные межхромосомные пере-
стройки (рис. 20).
Объектом исследования в данном случае являются особенности нуклео-
тидного состава конкретной хромосомы или ее отдельного участка.
47
Рис. 20. FISH-диагностика (кариотип матери). Сигнал сайт-специфичного
ДНК-зонда (зеленые точки) на участок хромосомы 7q21.3 имеется
в нормальной хромосоме 7 и остается в длинном плече der(7)
Классический метод FISH-анализа основан на гибридизации известного
по нуклеотидному составу ДНК-зонда с участком тестируемой хромосомы
и с последующим выявлением результата гибридизации по метке — флуорес-
центному сигналу в ожидаемом месте. Так как последовательность нуклеотидов зонда и анализируемого участка хромосомы комплементарны, зонд присоединяется к хромосоме при помощи водородных связей между азотистыми ос-
нованиями нуклеотидов — в данном участке происходит ренатурация ДНК.
Для визуализации зонды метят:
1) прямое мечение — в состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные
флуорофорами;
2) непрямое мечение — нуклеозиды мечены дигоксигенином (выявляют
при помощи флуоресцентно меченных антител) или биотином (при помощи
авидина или стрептавидина).
Преимуществом FISH-метода является возможность исследования как
метафазных хромосом, так и интерфазных ядер in situ. Кроме того, можно
идентифицировать хромосомные перестройки, не выявляемые при помощи цитогенетического метода, определить локализацию гена, а также выявить опре-
48
деленные мРНК в образце биоптата. FISH-метод позволяет провести анализ
всего за 1–3 дня и использовать одновременно несколько ДНК-зондов, меченных разными флуорофорами.
Метод FISH-анализа обладает высокой разрешающей способностью: на
препаратах можно выявлять те хромосомные нарушения, которые не визуализируются в обычный световой микроскоп. FISH-анализ позволяет выявить,
к примеру, несколько аномальных клеток среди тысяч клеток с нормальным генотипом. FISH-метод нашел широкое применение в картировании генома, хро-
мосомной локализации генов и последовательностей ДНК и РНК, анализе
идентификации хромосомных аномалий, включая микроделеции и микродупликации. Благодаря своей уникальности и специфичности метод гибридизации
в последнее время широко применяется при проведении преимплантационной,
пренатальной или постнатальной диагностики. Его используют в клинической
цитогенетике, онкогенетике, гематологии, при оценке мутагенных воздействий
(физических, химических, биологических), диагностике врожденных пороков
развития и умственной отсталости.
Для исследования опухолевых клеток было предложено использовать
комбинацию методов иммунофенотипирования и FISH, получившую название
FICTION. Для этого анализа используют неокрашенные мазки крови, костного
мозга или препараты других тканей. На первом этапе препараты инкубируют со
специфическими моноклональными антителами, затем проводят конъюгацию
с флуорофорами для последующей визуализации комплекса антиген-моноклональное антитело. Далее осуществляют гибридизацию in situ с ДНК-зондами.
Для выявления моноклональных антител и ДНК-зондов используют флуорофо-
ры, различающиеся по цвету. Изучение препарата под флуоресцентным микроскопом при наличии необходимого набора фильтров позволяет одновременно
проводить анализ фенотипа и гибридизационных сигналов в интерфазных
ядрах.
Цифровая запись микроизображений открыла возможность переведения
в псевдоцвета не только комбинации флуорофоров, но и соотношения их интенсивностей. Этот подход оказался продуктивен для разработки метода мно-
гоцветного бэндинга хромосом (MuliColor Banding — МСВ). Данный метод
предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения деталь-
ного анализа отдельной хромосомы. Локус-специфичные ДНК-зонды метят
различными флуорофорами или комбинациями флуорофоров так, что уровень
сигнала каждого из ДНК-зондов варьируется по интенсивности. Данный вариант многоцветного FISH-метода оказался высокоэффективным при анализе не
только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологи-
49
ческих заболеваниях. Однако для его успешного применения необходимо предварительно определить хромосому, которая будет исследована. Таким образом,
данный метод молекулярной цитогенетики подходит для анализа нарушений
кариотипа, ассоциированных с определенными хромосомами. К настоящему
времени созданы наборы ДНК-зондов, обеспечивающие проведение МСВ для
всех хромосом человека (рис. 21, 22).
Рис. 21. FISH с применением пробы многоцветного бэндинга (MCB)
для каждой пары хромосом. Метод позволяет с высокой точностью определить
точки разрыва перестроенных хромосом, внутрихромосомные аномалии
(делеции, инверсии, инсерции) и гены-кандидаты, участвующие
в аномалии (указаны стрелками)
Рис. 22. Многоцветный бэндинг пятой хромосомы человека
(иллюстрация MetaSystems GmbH)
50
Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH) был разработан
в 1992 г. и позволил провести скрининг всего кариотипа на предмет числовых
и несбалансированных хромосомных перестроек. Он основан на проведении
реакции гибридизации in situ с использованием в качестве ДНК-зонда всего ге-
нома. Исследуемую и нормальную донорскую ДНК метят флуорофорами раз-
ного цвета, превращая их таким образом в ДНК-зонды. Эквивалентные количе-
ства этих зондов смешивают и используют при гибридизации с контрольным
цитогенетическим препаратом.
После проведения FISH метафазы анализируют на флуоресцентном мик-
роскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерно-
го анализа изображений интенсивность флуоресценции двух флуорофоров по
всей длине каждой хромосомы. При отсутствии количественных изменений
в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться определенное соотноше-
ние интенсивности свечения двух флуорофоров. В случае амплификации генов
интенсивность сигнала соответствующего флуорофора будет усиливаться,
а в случае потери части генетического материала, наоборот, ослабевать. Таким
образом, CGH позволяет выявить геномный дисбаланс.
Однако этот метод нельзя использовать для обнаружения сбалансирован-
ных транслокаций и инверсий, а трисомии и делеции можно определить только
в том случае, если размер несбалансированного участка составляет не менее
10 млн нуклеотидных пар.
Многоцветное кариотипирование нашло широкое применение для
определения происхождения различных маркерных хромосом, которые часто
наблюдаются при онкогематологических заболеваниях. Такой анализ осу-
ществляется при использовании ДНК-зондов сплошного окрашивания к плечам
или целым хромосомам. Таким образом, при изучении под флуоресцентным
микроскопом хромосома выглядит равномерно окрашенной в определенный
цвет. Техника сплошного окрашивания хромосом стала предпосылкой для но-
вого способа исследования кариотипа — многоцветного кариотипирования
(M-FISH). Наиболее широкое распространение получил такой вариант M-FISH,
как 24-цветный FISH, предназначенный для одновременной идентификации
материала всех хромосом человека. Данный метод обладает высокой эффек-
тивностью при детекции хромосомных транслокаций, поскольку каждая пара
хромосом окрашена в свой псевдоцвет, но не позволяет выявлять делеции и ин-
версии (рис. 23).
В современных цитогенетических лабораториях процесс составления ка-
риограммы компьютеризирован. В настоящее время для кариотипирования
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]