Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
81
превышает пороговый уровень (обычно при высокой плотности клеток), он
вызывает аутоиндукцию, т. е. активацию определенных генов.
Особенностью этих веществ, которые называются ауторегуляторами,
является выделение их в окружающую среду, проявление биологической
активности в очень низких концентрациях (10–9 – 10–12 M) и воздействие не
на организмы другого вида, а на особи (клетки) того же самого вида. Эти
вещества клетки прокариот выделяют в обычных условиях культивирования
и обнаруживают строгую видо- или родоспецифичность. Однако язык
общения довольно разнообразен у бактерий, помимо внутривидовы, в нем
имеются еще и межвидовые сигналы, понятные также бактериям других
видов.
Выявление регуляторов жизнедеятельности прокариот на
межклеточном уровне, как нового класса веществ, интересно тем, что это
позволяет рассматривать данные организмы не просто как популяцию
разрозненных клеток, но указывает на существование более высокого уровня
их организации.
Местами действия ауторегуляторов являются клеточные ферменты.
Примечательно, что большинство известных ауторегуляторов являются
веществами липидной природы, благодаря чему они легко диффундируют
через клеточные мембраны без помощи специальных транспортных систем.
Ярким проявлением целостности микробных коллективов является
формирование надорганизменных структур, то есть образований, которые не
принадлежат никакой из клеток в отдельности, но важные для жизни
колонии как целого.
У прокариот самым распространенным типом таких структур является
межклеточный матрикс, который выполняет следующие роли:
1 Структурообразующую роль. Благодаря матриксу колония состоит,
строго говоря, не из одиночных клеток, а из субколониальных ассоциаций,
встречающихся и у грамотрицательных, и у грамположительных бактерий (в
82
том числе – у патогенных видов обоих этих групп). К структуре колоний
относятся также предполагаемые микроканалы для транспорта веществ – это
полые трубочки из внеклеточных полисахаридов и других биополимеров
(например, в колониях Pseudomonas aeruginosa), через подобные трубочки
мигрируют клетки колоний, представленные обычно в виде мелких L-форм.
Подобные «отстрелы», в частности, характерны для видов бактерий, которые
входят в состав симбиотической микробиоты животных и человека.
2 Защитную (протекторную) роль. Матрикс, который обволакивает
клетки, выступает как буферная внутренняя среда колонии, он предохраняет
отдельные клетки и колонию в целом от неблагоприятных воздействий
окружающей среды (атака гидролитических ферментов,
нагревание/охлаждение,высыхание, и др.). Пептидные и полисахаридные
компоненты матрикса, в частности, включают в себя ряд крио-, термо- и
ксеропротекторов.
3 Коммуникативную роль. В матрикс выделяются и по нему
распространяются продукты автолиза клеток и экзометаболиты, в том числе
химические сигнальные вещества, служащие для оценки плотности
собственной популяции. В некоторых случаях сигнальные вещества
присутствуют лишь в незначительных концентрациях в супернатанте
микробной культуры, так как задерживаются в матриксе, где и выполняют
свою функцию.
К настоящему времени собрано достаточное количество фактов,
свидетельствующие о наличии в прокариотических популяциях сложных
межклеточных взаимодействий. Эти факты подчас опровергают основные
постулаты Роберта Коха, в том числе и о том, что любая прокариотическая
клетка при росте в оптимальных условиях развития может дать популяцию,
то есть бактериальные культуры рассматривались ранее как совокупность
клеток, развивающиеся и делящиеся совершенно независимо друг от друга.
83
На сегодняшний день описан целый ряд сигнальных молекул, а также
показаны процессы у бактерий, в которых данные молекулы принимают
участие.
Работы 90-х годов резко усилили интерес к эффекту кворум сенсинга,
наблюдаемого в популяциях микроорганизмов. В настоящее время к числу
описанных процессов ,которые протекают лишь при достаточно высокой
плотности популяции, относятся следующие явления:
1 Биолюминесценция, наблюдаемая у морских бактерий Vibrio
fisheri и V.harveyi.
2 Агрегация клеток у миксобактерий и последующее
формирование плодовых тел со спорами.
3 Процессы споруляции у актиномицетов и бацилл.
4 Стимуляция роста у стрептококков и ряда других
микроорганизмов.
5 Конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и
родственных видов, а также у бактерий рода Agrobacterium.
6 Образование экзоферментов и ряда других факторов
вирулентности у патогенов растений (Erwinia hyacinthii, E.carotovora и др.) и
животных (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa).
7 Синтез антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у
E.carotovora.
8 Формирование клеток-швермеров у бактерий родов Proteus и
Serratia.
9 Формирование биопленок у бактерий Р.aeruginosa и других
видов микроорганизмов.
Рассмотрим общую схему реализации феномена кооперативной
чувствительности, представленную на рисунке 34.
Аутоиндукторы, которые продуцируются грамотрицательными и
грамположительными микроорганизмами различны по своей химической
84
природе. В наибольшей стеени известны видоспецифичные N-
ацилгомосеринлактоны, которые продуцируются грамотрицательными
микроорганизмами. Данные молекулы свободно диффундируют через
бактериальные мембраны во всех направлениях. При достижении некой
пороговой концентрации гомосеринлактоны связываются с молекулой
регуляторного протеина семейства LuxR, образуется комплекс, который
инициирует транскрипцию гена мишени.
А
Б
Рисунок 34 – Феномен кооперативной чувствительности у
грамотрицательных бактерий (А), у грамположительных бактерий (Б)
Позднее у грамотрицательных микроорганизмов были обнаружены
аутоиндукторы, по своей химической природе относящиеся к хинолонам и
85
дикетопиразинам, которые также могли свободно диффундировать через
бактериальные мембраны.
Аутоиндукторы же грамположительных бактерий представляют собой
короткие пептиды, подвергающиеся посттрансляционной модификации. Для
их экспорта в окружающую среду необходимы специальные секреторные
системы, а для распознавания и генерации ответной реакции –
двухкомпонентные системы передачи сигналов.
4.1 Особенности реакций «quorum sensing» у грамположительных
микроорганизмов
Грамположительные бактерии осуществляют коммуникации, как
правило, используя олигопептидные сигнальные молекулы. В большинстве
случаев передача сигналов включает в себя двухкомпонентный механизм
фосфорилирования.
Как правило, при переходе в стационарную фазу роста популяция
бактериальных клеток достигает состояние кворума, и именно в это время
обнаруживаются сигнальные молекулы, по средствам которых клетки
контактируют друг с другом.
У грамположительных бактерий общую схему коммуникаций можно
представить следующим образом:
1 Первоначально в клетке синтезируется предшественник, который
затем модифицируется и превращается в зрелый олигопептид.
2 С помощью экспортера зрелый олигопептид экскретируется
клетки наружу.
3 По мере того как возрастает бактериальная плотность, в
межклеточном пространстве накапливаются молекулы олигопептида.
86
4 Пронизывающая мембрану двухкомпонентная сенсорная киназа
распознает сигнал и в процессе каскадного фосфорилирования осуществляет
его передачу в клетку.
5 В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым
геном (генами).
Рассмотрим некоторые примеры межклеточной коммуникации у
грамположительных микроорганизмов.
Систему, которая отвечает за конъюгативный перенос плазмид у
Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов, можно считать
классическим примером кворум-зависимой системы у грамположительных
микроорганизмов. У Enterococcus faecalis установлен половой процесс. В
клетках-реципиентах происходит синтез специфических ауторегуляторов
(половые регуляторы, или феромоны), под их воздействием клетки-доноры
приобретают способность прилипать к реципиенту, в результате чего
повышается вероятность образования пары донор-реципиент. Данная
система стимулирует распространение признаков в микробной популяции,
необходимых для взаимодействия животного-хозяина и микроорганизма, а
также для устранения конкуренции.
Плазмида pCDl, отвечающая за образование бактериоцина, плазмида
pPDl – за синтез гемолизинов, а плазмида pCFlO – за устойчивость E.faecalis
к тетрациклину переносятся как раз пептидной кворум-зависимой системой.
Каждый гекса- или октапептид будет индуцировать слипание
бактериальных клеток и их конъюгацию с последующим переносом от
донора к реципиенту определенной плазмиды. Так, например, октапептид
cPDl стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPDl, кодирующей
рецептор, который находится на белке-репрессоре соответствующего
оперона. В результате взаимодействия олигопептида с рецептором
происходит диссоциация репрессора от ДНК и запуск синтеза
соответствующего продукта. Плазмида pPDl включает также ген traC,
87
продуктом которого является белок, который облегчает проникновение
пептида через клеточную стенку.
Клетки, интенсивно синтезирующие олигопептидные сигналы, не
несут соответствующие плазмиды (реципиенты), в то время как у клеток-
доноров синтез таких сигналов подавлен, более того, плазмида кодирует
ингибирующий пептид. Так, продуктом плазмиды pPDl является октапептид
cPDl и ингибирующий пептид iPDl.
Примером использования пептидного сигнала для осуществления
межклеточного взаимодействия может служить система кворум-сенсинга,
которая осуществляет контроль над синтезом экзотоксинов у Staphylococcus
aureus в поздней логарифмической фазе роста. В этой системе белок AgrD
синтезируется в виде предшественника, содержащего из 46 аминокислот,
который превращается в зрелый пептид AIP (autoinducing peptide), состоящий
из 8 аминокислот, в процессе экспорта белком AgrB. Двухкомпонентная
сенсорная киназа AgrC распознает AIP и в процессе фосфорилирования
регулятора ответа – AgrA передает сигнал внутрь клетки. AgrA~P активирует
транскрипцию целевых генов и стимулирует транскрипцию оперона
agrBDCA (положительная ауторегуляторная петля), а также «запрещает»
транскрипцию генов, которые кодируют другие экзотоксины.
Таком образом, все штаммы Staphylococcus aureus могут быть
отнесены к четырем или более группам на основании различий в AIP и его
рецепторе. При этом синтезируемые одной из групп олигопептиды
индуцируют патогенность в этой группе и специфически подавляют системы
Agr-вирулентности в других группах.
От плотности популяции также зависит появление компетентности у
Streptococcus pneumoniae в поздней логарифмической фазе роста. Ген соmС
кодирует предшественник, который состоит из 41 аминокислотного остатка.
Далее последний в процессе взаимодействия с системой экспорта пептидов
(АВС-система), образованной продуктами генов соmАВ, преобразуется в
88
зрелый пептид, содержащий 17 аминокислотных остатков. Пептид
контактирует со своим рецептором на поверхности клетки –
гистидинкиназой, являющийся продуктом гена comD. Далее активированная
гистидинкиназа фосфорилирует продукт гена соmЕ.
По мере того, как происходит накопление бактериальных клеток
количество пептидных сигналов растет и достигает в среде критического
(порогового) уровня. В соответствии с этим происходит увеличение
количества фосфорилированного белка cоmЕ, который, начиная с
определенной концентрации, связывается с промотором оперона comCDE,
стимулирует его работу (положительная ауторегуляторная петля), а также
активирует промоторы оперона соmАВ (система экспорта белка из клетки),
соmХ, включающий целую цепочку поздних генов компетентности, которые
отвечают за связывание и поглощение трансформирующей ДНК и все
остальные, поздние стадии трансформации.
Также у грамположительных бактерий к приведенным примерам
реакций кворум-сенсинга необходимо добавить, что, помимо олигопептидов,
в качестве сигнальных молекул грамположительными бактериями также
используются вещества другой химической природы. Так, например, у
представителей порядка Actinomycetales, помимо пептидных сигнальных
молекул, были обнаружены вещества низкомолекулярной природы,
большинство из которых содержали лактонную группировку.
В системе кворум-сенсинга у представителей Streptomyces вовлечены
бутиролактоны и соответствующие им белковые рецепторы, совместно
регулирующие образование антибиотиков у их продуцентов и собственно
морфологическое развитие. Наиболее полно изученным актиномицетным
регулятором является А-фактор, который представляет собой 2-изокаприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.
Влияние А-фактора на морфологическую дифференцировку и
антибиотикообразование подчиняется общей схеме работы стрептомицетных
89
регуляторов, которые содержат лактонную группировку. На ранних стадиях
роста, когда еще концентрация А-фактора низкая, рецептор А-фактора
(AgrА) связывается и репрессирует экспрессию общего гипотетического
активатора биосинтеза стрептомицина и спорообразования. При выделении
из клеточного лизата S.griseus IFO 13350 AgrА было обнаружено, что этот
белок содержит 276 аминокислот и имеет молекулярную массу 29,1 кДа.
Концентрация А-фактора достигает критического уровня при
увеличении плотности бактериальной культуры, при этом он связывает
AgrА, вызывает его диссоциацию от ДНК и, таким образом, включает
транскрипцию ключевого гена adpA, который кодируюет AdpA (белок,
который состоит из 405 аминокислот и содержит в центральном участке сайт
связывания с ДНК, схожий с регуляторами транскрипции из семейства
белков AraC/XylS). В свою очередь, AdpA является позитиположительным
регулятором обнаруженного цитоплазматического активатора кластера генов
биосинтеза стрептомицина и активаторов процесса спорообразования.
Цитоплазматический активатор связывается с молекулой ДНК в
области промотора гена специфической регуляции кластера биосинтеза
стрептомицина strR и вызывает индукцию транскрипции данного гена, а
также расположенных вслед за ним других генов, в частности, гена
устойчивости к собственному антибиотику – aphD, гена adsA, который
кодирует экстрацитоплазматический А-фактор РНК-полимеразы,
используемой для формирования воздушного мицелия, гена sgmA,
кодирующего фермент пептидазу, которая наряду с другими
гидролитическими ферментами будет участвовать в деградации белков
субстратного мицелия в результате формирования воздушного мицеля. В
составе кластера с StrR-зависимых промоторов регуляторный продукт гена
strR обусловливает начало транскрипции структурных генов биосинтеза, а
под влиянием цитоплазматического активатора начинается экспрессия с
промотора strR гена, что обеспечивает также наработку продукта гена aphD,
90
ответственного за синтез аминогликозидфосфотрансферазы, что создает
базовый уровень устойчивости штамма к собственному антибиотику.
У разных видов Streptomyces была показана гомология между
структурными элементами регуляторов. Гомологичные гену agrА у S.griseus,
нуклеотидные последовательности обнаружены также у других
стрептомицетов. Так например, у S.coelicolor A3 были обнаружены два гена
cpgА и cpgВ, которые кодируют AgrА-подобные белки CpgА и CpgВ,
сходные между собой на 90,7 % и на 35 % – с AgrА.
4.2 Особенности реакций «quorum sensing» у грамотрицательных
микроорганизмов
Кворум-зависимые системы были обнаружены более чем у 450 видов
грамотрицательных бактерий, сигнальными молекулами которых служат
различные ацилгомосеринлактоны.
У грамотрицательных бактерий общую схему коммуникаций можно
представить следующим образом: в системе кворум-сенсинга
грамотрицательных бактерий белки семейства LuxI, являющиеся
аутоиндукторными синтетазами, катализируют образование специфических
ацилгомосеринлактонных аутоиндукторных молекул, которые свободно
диффундируют через мембрану и по мере увеличения плотности клеток
аккумулируются.
При достижении достаточно высокой концентрации сигнальных
молекул белки семейства LuxR связывают родственные им аутоиндукторы.
Данный комплекс LuxR-аутоиндуктор, связываясь с промотором,
запускает транскрипцию целевых генов.
В 1970 году впервые была обнаружена и к настоящему времени
подробно описана lux-система типа «quorum sensing» у морских бактерий
Vibrio fischeri (рисунок 35), определяющая особенности интенсивности
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]