Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
31
происходит резкое повышение каталитической активности данного
фермента.
Активность глутаминсинтетазы многих других видов бактерий не
регулируется путем ковалентной модификации.
Согласно Эгереру и др. цитратлиаза расщепляет цитрат на
оксалоацетат и ацетат. Фермент активен, если клетки могут использовать
цитрат в качестве субстрата. В этих условиях децетилирующих фермент
ингибируется L-глутаматом, для которого цитрат служит предшественником.
В отсутствии цитрата концентрация глутамата в клетках уменьшается и
цитратлиаза инактивируется специфической деацетилазой. Если цитрат снова
становится доступным для клеток, путем ацетилирования образуется
активная форма фермента. Система регуляции цитратлиазы особенна тем,
что модификатор структуры фермента (ацетильная группа) участвует в
ферментативной реакции. Ацетильная группа участвует в первой стадии
трансферазой реакции, поэтому очевидно, что HS-фермент должен быть
неактивным.
32
3 Регуляция синтеза ферментов
При регуляции активности аллостерическоих ферментов
соответствующими конечными продуктами обеспечивает мгновенную
реакцию, которая будет приводить к изменению выхода продукта
определенного биосинтетического пути. Однако, в ситуации, когда конечный
продукт оказывается ненужным, то отпадает необходимость ферментов,
катализирующих определенный биосинтетический путь.
Поэтому существуют эволюционно устоявшиеся механизмы,
позволяющие максимально экономично регулировать клеточный
метаболизм путем регуляции ферментного состава клетки. Ведь в
конкретных условиях целесообразен синтез только тех ферментов, которые
востребованы в данный промежуток времени. Именно поэтому одни и те же
ферменты при разных условиях могут присутствовать в клетке в следовых
количествах – 1-2 молекулы или составлять несколько процентов от
клеточной массы.
Такая регуляция количества определенного фермента в клетке может
осуществляться на нескольких уровнях его синтеза – на этапе транскрипции,
трансляции или уже в процессе его сборки и разрушения.
Наиболее сложным механизмом в иерархии регуляторных
воздействий, контролирующим количество фермента в клетке является
механизм, связанный с процессом транскрипции. В данном случае
специфические химические сигналы инициируют или блокируют
транскрипцию определенного участка ДНК с образованием мРНК. Если
происходит индукция, то образованная мРНК будет участвовать в
дальнейшем в последовательности реакций – трансляции и заканчиваться
синтезом белка-фермента.
На этапе трансляции регуляция синтеза полипептидных цепей может
осуществляться на любом из ее уровней. Также существует возможность
33
изменения времени жизни мРНК под воздействием различных молекул,
которыми могут быть конечные продукты метаболического пути.
Неоспорим тот факт, что фермент может выполнять свою
каталитическую функцию только после приобретения соответствующей
структуры высшего порядка, скорость образования которой также будет
находиться под контролем определенных эффекторов. В результате мы
будем иметь контроль и на уровне сборки фермента, способного выполнять
определенную метаболическую роль. И наконец, определять концентрацию
фермента в клетке будет регуляция скорости его разрушения под
воздействием специфических метаболических сигналов.
При регуляции синтеза ферментов на этапе «считывание»
бактериальных генов будет происходить избирательно и скорость
образования копий соответствующих мРНК и, следовательно, трасляция
мРНК в белки, будет находиться под сложным контрольным механизмом.
Именно на этапе транскрипции скорость синтеза ферментов будет
изменяться особенно по-разному. В этом случае все ферменты организма
делятся на два класса. Первый класс составляют ферменты,
синтезирующиеся в живой клетке с постоянной скоростью в результате
постоянного транскрибирования соответствующих генов. Такие ферменты
будут присутствовать в клетке в более или менее постоянной концентрации,
называться конститутивными. К ним относят гликолитические ферменты.
Метаболические же пути, которые функционируют при участии
конститутивных ферментов, будут контролироваться другими
регуляторными воздействиями, например аллостерическим ингибированием.
Однако помимо конститутивных ферментов в клетках бактерий
синтезируются ферменты, количества которых зависят от субстратного
состава среды. Это связано с тем, что гены, кодирующие эти ферменты будут
включаться или выключаться по мере надобности. Такие ферменты
составляют второй класс и называются индуцибельными
34
(адаптивными).Если в среде будут отсутствовать субстраты этих ферментов,
то количество последних в клетке будет находиться в следовых количествах
и такие ферменты будут синтезироваться только в ответ на наличие в среде
необходимого для клетки субстрата. Такой субстрат называется индуктором
и посредством взаимодействия с репрессором будет его инактивировать его,
что поведет за собой включение генетического аппарата клетки и начнется
синтез соответствующего фермента. И пока в среде присутствует индуктор
будет и индуцироваться синтез соответствующих ферментов. Такими
индукторами могут являться многие питательные вещества. К
индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.
В соответствии с этой классификацией все гены организма также
можно разделить на две большие группы: конститутивные и индуцибельные.
Конститутивные гены постоянно включены и будут функционировать на
всех стадиях онтогенеза и во всех тканях. К таким конститутивным генам
относятся гены, ответственные за синтез тРНК и рРНК, РНК- и ДНКполимеразы, белков-гистонов, белков рибосом и т.д. Иначе их называют
«генами домашнего хозяйства», или существенными генами, без которых
клетки существовать не могут.
Индуцибельные же гены будут функционировать только на
определенных этапах онтогенеза и в разных тканях, будут включаться и
выключаться, а их активность регулируется по принципу «больше или
меньше». Такие гены называют «генами роскоши» и они часто являются
несущественными. Именно их включение называют индукцией, а
выключение – репрессией, а молекулярно-генетические системы управления
будут производить регуляцию активности таких генов.
В случае уменьшения содержания глутамина остатки AMP
переносятся на неорганический фосфат и активность фермента снова
восстанавливается. Взаимопревращение двух форм фермента катализируется
аденилтрансферазой вместе с регуляторным белком РII, который может
35
уридилироваться за счет UTP (уридилтрифосфат). Для деаденилирования
необходим UTP (для присоединения уридилового остатка к Р
образованием Р
– UTP), α-оксоглутарат и отсутсвие глутамина; для
II
II
с
аденилирования необходимы глутамин, низкое содержание α-оксоглутарата и
наличие РII. В присутствии уридилированного белка (Р
– UTP) трансфераза
II
катализирует деаденилирование синтетазы, в противном случае происходит
аденилирование.
Если максимальная частота транскрипции оперонов будет достигаться
только, когда в окружающей среде присутствуют внешние эффекторы
(внешние индукторы), например, лактоза, арабиноза или галактоза, то такие
оперона называются индуцибельными. К таким оперонам можно
соответственно отнести лактозный, арабинозный или галактозный и синтез
кодирующих ими ферментов будет включаться посредством индукции.
Опероны, отвечающие за синтез гистидина, аргинина или триптофана,
являются репрессибельными, то есть при отсутствии или в концентрации
ниже порогового уровня в окружающей среде и соответственно в клетке
низкомолекулярных эффекторов – гистидина, аргинина и триптофана будет
достигаться максимальная частота транскрипции.
3.1 Организация оперона бактериальных генов
Единицей регуляции экспрессии генов у прокариот является оперон.
Рассмотрим структуру оперона на примере lac-оперона у E.coli (рисунок 13).
Оперон – это участок бактериальной хромосомы, включающий
следующие участки ДНК: промотор, оператор, структурные гены,
терминатор. В состав оперонов может входить до 10 структурных генов и
более.
Промотор – это регуляторный участок молекулы ДНК, который
служит для присоединения РНК-полимеразы и который определяет точку
36
начала транскрипции. Типичный пример – TTGACA – 17 bp – TATAAT. В
зависимости от типа промотора (а точнее, от типа распознающей его сигма -
субъединицы РНК полимеразы) конкретная последовательность промотора
варьирует.
Р – промотор; О – оператор; z, y, a – структурные гены; Т –
терминатор.
Рисунок 13 – Организация lac-оперона у E.coli
Оператор – это регуляторный участок ДНК, способный присоединять
белок-репрессор, который кодируется соответствующим геном.
Располагается оператор в непосредственной близости к промотору или же
перекрывается с ним. В случае негативных регуляторов, или репрессоров,
оператор, как правило, располагается непосредственно за промотором, или
перекрывается с ним. Если репрессор присоединен к оператору, то РНКполимераза не может двигаться вдоль молекулы ДНК и синтезировать мРНК.
В случае позитивных регуляторов (активаторов) оператор обычно
располагается перед промотором. В любом случае связывание регуляторного
белка с оператором меняет частоту инициации транскрипции. У многих
(возможно, у большинства) оперонов имеется не один, а несколько сайтов
связывания с регуляторными белками, которые не обязательно
располагаются рядом и могут вообще находиться по разные стороны от
промотора. В этих случаях термин «оператор» в классическом смысле
становится неудобным, в связи с чем сейчас чаще просто говорят о сайтах
связывания регуляторов.
Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого
белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК,
37
которая затем поступает в рибосому и служит матрицей для биосинтеза
белка. Именно для контроля их экспрессии, собственно, и существуют
оперонные структуры вместе со своими регуляторами.
Именно ген-оператор является «пусковым механизмом» для
функционирования структурных генов и контролирует синтез мРНК,
происходящий на структурных генах молекулы ДНК. Локализация генаоператора чаще всего связана с крайними отрезками структурного гена или
структурных генов, регулируемых им.
Регуляторным участком ДНК, служащим для отсоединения РНКполимеразы после окончания синтеза мРНК на молекуле ДНК, является гентерминатор.
При этом гены в опероне не родственны по происхождению, что не
говорит о том, что оперонная организация не отражает генезиса генов,
однако объединяет гены функционально, что с точки зрения регуляции дает
определенные преимущества. В этом случае проблемой для клетки является
дифференциация одной единой регуляторной системы на каждый ген по-
отдельности. Объединение же в опероны генов, близких функционально
сложтлось в эволюции постепенно и связано с тем, что перенос генетической
информации осуществляется обычно небольшими участками ДНК. В
качестве преимущества можно выделить то, что такое сцепление
функционально близцих в родственном плане генов позволяет бактериям
приобрести необходимое свойство или функцию в один этап.
Считывание генетической информации с молекулы ДНК и синтез
мРНК обеспечивается ферментом РНК-полимеразой. Структура РНК-
полимеразы предполагает наличие белка, распознающего промотор и
помогающего РНК-полимеразе на него сесть и начать транскрипцию – σ-
фактора, что обеспечивает переключение работы больших групп генов. Такая
системная регуляция позволяет клетке переключаться с одной жизненной
программы на другую.
38
Деятельность оперона находится под контролирующим влиянием
другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора.
Поскольку структурные гены и ген-регулятор находятся в разных участках
цепи ДНК, связь между ними, как предполагали Ф.Жакоб и Ж.Моно,
осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и
названного репрессором.
Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице
специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет
ДНК-связывающий домен, основу которого составляют две α-спирали,
расположенные под углом друг к другу, таким образом одна из спиралей
ложится в большую бороздку ДНК (рисунок 14).
Рисунок 14 – Репрессор с ДНК-связывающим доменом в процессе
соединения с большими бороздами молекулы ДНК
Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с
ним в комплекс (рисунок 15). Репрессор обязан иметь ДНК-связывающий
домен. В одном из наиболее распространенных случаев его основу, как уже
говорилось выше, составляют две α-спирали, расположенные под углом друг
39
к другу, так что одна из спиралей ложится в большую бороздку ДНК. Кроме
того, часть белков имеет на N-конце гибкую «руку», охватывающую
молекулу ДНК со стороны, противоположной узнающей спирали. Белок
может прочно связаться с ДНК только в том случае, если имеется
соответствие между боковыми цепями аминокислотной узнающей α-спирали
и функциональными группами ДНК, экспонированными в большой желобок.
Очень часто ДНК-связывающие белки имеют второй домен,
отвечающий за димеризацию белка. При наличии таких доменов сила
связывания репрессора с ДНК резко возрастает. Именно поэтому операторы
имеют структуру палиндрома – с каждой половиной оператора
взаимодействует одна молекула белка, причем связывание одной молекулы
ускоряет связывание второй, в результате сила связывания регуляторного
белка с оператором возрастает. Такое явление называется кооперативностью.
Более того, зачастую операторные сайты располагаются рядом, и тогда
связывание одного димера белка может кооперативно способствовать
связыванию второго димера.
Рисунок 15 – Непосредственное взаимодействие репрессора с
промоторной областью ДНК
40
В случае репрессоров такое связывание либо создает стерическое
затруднение для связывания РНК-полимеразы с промотором, либо
препятствует дальнейшему продвижению РНК-полимеразы в тех случаях,
когда оператор расположен после промотора.
В случае активаторов возможны несколько механизмов. Первый
связан с непосредственным взаимодействием активатора с полимеразой,
обеспечивающим более сильное связывание с промоторной областью, второй
– с облегчением локального расплетания ДНК в области промотора
(необходимого для инициации транскрипции) либо за счет внесения изгиба в
ДНК, либо за счет увеличения отрицательной суперскрученности. Вторая
модель довольно часто привлекалась для объяснения механизма действия
CAP, но в настоящее время большинство фактов свидетельствует в пользу
первой модели даже для этого белка. В соответствии с местом контакта
активатора с РНК-полимеразой активаторы можно подразделить на
следующие группы (рисунок 16): контактирующие с карбокси-концом αсубъединицы РНК-полимеразы (αCTD), активаторы, контактирующие с σ70субъединицей РНК-полимеразы, активаторы, имеющие два контакта с РНК-
полимеразой, и, наконец, активаторы, действующие путем изменения
конформации промотора.
Наиболее изученным представителем класса активаторов,
контактирующих с карбокси-концом α-субъединицы РНК-полимеразы
(αCTD) (рисунок 16А) является CAP. Сайт связывания для этого белка
располагается перед -35 последовательностью. Интересно, что сайты
связывания активаторов этого класса располагаются на различных
расстояниях от промотора. Это объясняется структурой αCTD. Эта
субъединица РНК-полимеразы состоит из двух доменов, соединенных между
собой гибким линкером. N-концевой домен контактирует с другими
субъединицами РНК-полимеразы и поэтому жестко зафиксирован, тогда как
αCTD достаточно подвижен и поэтому может контактировать с
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]