Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
21
Если первый этап биосинтетического пути катализируется одним
ферментом, на поверхности молекулы этого фермента имеются различные
регуляторные центры, с каждым из которых связывается один из конечных
продуктов, выполняющих функцию эффектора (рисунок 8, 1).
Некоторые аллостерические ферменты существуют в виде нескольких
молекулярных форм (изоферментов), которые катализируют одну и ту же
реакцию, но обладают разными регуляторными свойствами. Это связано с
тем, что изоферменты имеют одинаковые каталитические, но разные
регуляторные центры. Каждый изофермент кодируется отдельным геном.
Существование изоферментов позволяет конечным продуктам независимо
друг от друга ингибировать активность определенного изофермента, так как
каждый изофермент индивидуально контролируется «своим» конечным
продуктом (рисунок 8, 2).
На рисунке 9 суммированы ингибиторные эффекты аминокислот –
производных аспартата. Активность аспартаткиназы I и
гомосериндегидрогеназы I контролируется L-треонином. Активность
аспартаткиназы III регулируется L-лизином. Интересно, что изофермент II
не ингибируется L-метеонином по типу обратной связи; L-метеонин
ингибирует фермент, катализирующий первую стадию биосинтеза
собственно метионина (О-сукцинилгомосерин-синтетазу).
На рисунке 10 приведена схема контроля активности ферментов
биосинтеза ароматических аминокислот у E.coli. Одна 3-дезокси-Dарабиногептулозанат-7-фосфат-синтетаза ингибируется L-фенилаланином,
вторая – L-тирозином. Третий фермент – с самой низкой активностью – не
ингибируется триптофаном. Однако триптофан ингибирует антранилат-
синтазу. Обе хоризматмутазы также находятся под контролем
соответствующих конечных продуктов.
22
Рисунок 9 – Ингибирование по типу обратной связи в цепи
превращений, ведущих к образованию из аспартата группы аминокислот,
относящихся к с семейству аспарагиновой кислоты, у E.coli
Большинство энтеробактерий содержит три 3-дезокси-Dарабиногептулозонат-7-фосфат-синтетазы, активность которых регулируется
сходным образом. У представителей же Bacillus имеется только одна
синтетаза; она ингибируется не конечным продуктом, а промежуточными
продуктами, локализованными в месте ветвления метаболического пути
хоризматом или префенатом. Такой тип регуляции активности называется
последовательным ингибированием по типу обратной связи.
23
Рисунок 10 – Ингибирование по типу обратной связи в цепи
превращений ароматических аминокислот у E.coli
Еще один способ регуляции метаболизма ароматических аминокислот
был обнаружен у бактерий, окисляющих водород, таких, как Alcaligenes
eutrophus. При этом 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтетаза
подвергается кумулятивному ингибированию фенилаланином и тирозином. В
таблице 1 показано относительное (в процентах) ингибирование этого
фермента фенилаланином, тирозином и их смесью. Степень ингибирования
не суммируется и остаточная активность фермента при ингибировании
смесью равна произведению остаточных активностей при ингибировании
фенилаланином и тирозином по отдельности, что характерно для
кумулятивного ингибирования.
24
Таблица 1 – Регуляция активности 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-
Аминокислота,
присутствующая в
реакционной смеси
Ингибирование,
%
Остаточная активность (100 % = 1)
наблюдаемая
рассчитанная
Фенилаланин
25
0,75
0,75
Тирозин
47,5
0,525
0,525
Смесь
58,2
0,418
(0,75×0,525=) 0,394
7-фосфат-синтетазы путем кумулятивного ингибирования
Из приведенных примеров ингибирования по типу обратной связи
видно, что в большинстве случаев ингибиторы по своей химической природе
существенно отличаются от субстратов соответствующих ферментов. Так,
карбамоилфосфат и аспартат, субстраты аспартаттранскарбамилазы, сильно
отличаются от ингибитора этого фермента, СТР. Поэтому маловероятно, что
СТР конкурирует с субстратами аспартаттранскарбамилазы за активный
центр фермента, как молонат с сукцинатом в случае сукцинатдегидрогеназы.
Поскольку ингибиторы не являются стерическими аналогами субстратов,
ферменты содержат специальные участки связывания ингибиторов –
аллостерические центры.
В результате, соединения, которые связываются с этими центрами и
изменяют активность ферментов, называются аллостерическими
эффекторами, а ферменты, активность которых эти эффекторы
контролируют, – аллостерическими ферментами.
2.2 Типы ингибирования
Действие ферментов можно полностью или частично подавить
(ингибировать) определенными химическими веществами (ингибиторами).
25
Ингибиторами (от лат inhibeo – останавливаю, сдерживаю) называют
вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций,
катализируемых ферментами. Ингибирование характерно для
каталитических и цепных реакций, которые протекают с участием активных
центров или активных частиц. Тормозящее действие обусловлено тем, что
ингибиторы блокируют активные центры катализатора или реагируют с
активными частицами с образованием малоактивных радикалов, не
способных продолжать цепь. Ингибитор вводится в систему в концентрации
много меньшей, чем концентрации реагирующих веществ. Кинетика реакций
с участием ингибиторов принципиально различна для каталитических и
цепных реакций. В каталитической реакции число активных центров
фиксировано и ингибиторы, блокируя часть из них, не расходуются в ходе
процесса. Поэтому при введении ингибитора скорость реакции снижается, а
затем процесс протекает длительное время с постоянной скоростью. В
некоторых случаях эта скорость может медленно возрастать из-за
расходования ингибитора в какой-либо побочной реакции. В цепной реакции
активные частицы непрерывно генерируются, что приводит к расходованию
ингибитора и постепенному самоускорению реакции (в случае цепной
неразветвленной реакции обычно восстанавливается исходная скорость).
По характеру действия ингибиторы могут быть обратимыми и
необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения
ингибитора с ферментом. Если молекула ингибитора вызывает стойкие
изменения или модификацию функциональных групп фермента,
необходимых для проявления его активности, то говорят о необратимом
ингибировании. При этом они необратимо, часто ковалентно, связываются с
ферментом или фермент-субстратным комплексом и необратимо изменяют
нативную конформацию. Это, в частности, объясняет действие Hg
2+
, Pb2+,
соединений мышьяка. Ингибиторы такого рода могут быть полезны при
изучении природы ферментативного катализа.
26
Другой способ деления ингибиторов основывается на характере места
их связывания. Одни из них связываются с ферментом в активном центре, а
другие – в удаленном от активного центра месте – аллостерическом центре. В
зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение
ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата
разделяют конкурентное и неконкурентное ингибирование.
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами,
имеющими сходство с субстратом, неконкурентное же вызывают вещества,
связывающиеся с ферментом (не с активным центром) и тормозящие его
действие. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание
с активным центром. Это происходит потому, что ингибитор и субстрат
имеют сходные структуры. В отличие от субстрата связанный с ферментом
конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению.
Более того, образование комплекса уменьшает число молекул
свободного фермента, и скорость реакции снижается. Связывание субстрата
и ингибитора происходит взаимоисключающим образом. Образуется либо
фермент-субстратный, либо фермент-ингибиторный комплекс, но не
комплекс фермент-ингибитор-субстрат.
Так как конкурентный ингибитор (I) обратимо связывается с
ферментом (E), то можно сдвинуть равновесие реакции E + I ↔ EI влево
простым увеличением концентрации субстрата (S).
Конкурентными ингибиторами являются многие
химиотерапевтические средства. Например, сульфамидные препараты,
используемые для лечения инфекционных болезней и являющиеся
структурными аналогами парааминобензойной кислоты, из которой в клетке
микроорганизма синтезируется кофермент (Н
-фолат), участвующий в
4
биосинтезе нуклеиновых оснований. Нарушение синтеза нуклеиновых
кислот приводит к гибели микроорганизмов.
27
Неконкурентное обратимое ингибирование не может быть ослаблено
или устранено повышением концентрации субстрата, так как эти ингибиторы
присоединяются к ферменту не в активном центре, а в аллостерическом.
Реакциями неконкурентное ингибирование можно выразить таким
образом: E + I ↔ EI; ES + I → ESI. Связывание приводит к изменению
конформации фермента и нарушению комплементарности к субстрату.
Неконкурентные ингибиторы могут обратимо связываться как со свободным
ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом. Наиболее важными
неконкурентными ингибиторами являются образующиеся в живой клетке
промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться с
определенными участками ферментов (аллостерические центры) и изменять
их активность, что является одним из способов регуляции метаболизма.
Исследование действия ингибиторов используется при изучении
механизма действия фермента, кроме того, помогает в поисках более
эффективных лекарственных средств, так как лечебное действие многих
лекарств обусловлено тем, что они являются ингибиторами определенных
ферментов. Структурные аналоги коферментов тоже могут быть
ингибиторами.
2.3 Химическая модификация
В последние годы все больше и больше приходят к выводу о важной
роли данного механизма регуляции активности фермента. В то время как при
аллостерической регуляции низкомолекулярное соединение (метаболит)
связывается с ферментом или освобождается из комплекса с ферментом, при
данном типе регуляции фермент подвергается ковалентному изменению в
реакции, катализируемой специальным ферментом. Принцип такого
регуляторного механизма ясен из следующих уравнений:
28
Фермент–Х (активный) → Фермент + Х (неактивный)
Фермент + Х (активный) → Фермент–Х (неактивный)
Как видно, рассмотренные здесь ферменты существуют в двух
формах, активной и неактивной, и эти формы способны переходить одна в
другую. Эти две формы фермента различаются тем, что в одном случае
фермент несет ковалентно-связанную с ним группировку (X), а в другой нет.
Первый такой фермент, существующий в двух формах, обнаружили
Кори и сотрудники. Это была мышечная гликогенфосфорилаза у эукариот.
Необходимо отметить, что активность гликогенфосфорилазы прокариот не
регулируется путем ковалентной модификации и что модификация
ферментных систем путем фосфорилирования-дефосфорилирования, как
правило, более распространена у эукариот.
Примером ферментных систем у прокариот, регулирующихся путем
ковалентной модификации, могут служить глутаминсинтететаза у E.coli и
цитратлиаза у Rhodopseudomonas gelatinosa. Так активность
глутаминсинтетазы E.coli регулируется путем аденилированиядеаденилирования, а активность цитратлиазы Rhodopseudomonas gelatinosa –
путем ацетилирования-деацетилирования.
Глутаминсинтетаза E.coli – фермент, катализирующий синтез
глутамина, существует в двух химически неравноценных по своей
активности формах, различающихся присутствием/отсутствием остатка
адениловой кислоты:
На рисунке 11 приведена схема регуляции активности
глутаминсинтетазы, предложенная Стэдманом и Хольцером и их
сотрудниками. Этот фермент состоит из 12 субъединиц. Его
29
деаденилированная форма очень активна. При высоком содержании
глутамина и низком – α-оксоглутарата в каждой субъединице фермента
аденилируется один остаток тирозина. В таком состоянии фермент обладает
низкой активностью и к тому же подвергается кумулятивному
ингибированию по типу обратной связи такими соединениями, как AMP,
CMP, триптофан, гистидин, глюкозамин-6-фосфат и карбамоилфосфат.
Рисунок 11 – Регуляция активности глутаминсинтетазы E.coli путем
ковалентной модификации
В случае уменьшения содержания глутамина остатки AMP
переносятся на неорганический фосфат и активность фермента снова
восстанавливается. Взаимопревращение двух форм фермента катализируется
аденилтрансферазой вместе с регуляторным белком РII, который может
уридилироваться за счет UTP (уридилтрифосфат). Для деаденилирования
необходим UTP (для присоединения уридилового остатка к Р
образованием Р
– UTP), α-оксоглутарат и отсутсвие глутамина; для
II
II
с
аденилирования необходимы глутамин, низкое содержание α-оксоглутарата и
30
наличие РII. В присутствии уридилированного белка (Р
– UTP) трансфераза
II
катализирует деаденилирование синтетазы, в противном случае происходит
аденилирование.
Рисунок 12 – Регуляция активности цитратлиазы у
Rhodopseudomonas gelatinosa путем ацетилирования и деацетилирования
Аналогичным механизмом регулирования активности фермента путем
присоединения и удаления функциональной группировки, в частности,
остатка уксусной кислоты путем ацетилирования/деацетилирования
регулируется фермент цитратлиаза у фотосинтезирующей бактерии
Rhodopseudomonas gelatinosa. В данном случае активна будет
ацетилированная форма цитратлиазы (рисунок 12).
Таким образом, присоединение остатка адениловой кислоты
ковалентными связями, катализируемое соответствующим
модифицирующим ферментом, приводит к образованию менее активной
аденилированной глутамин-синтетазы. При удалении же адениловой группы,
приводящейе к возникновению деаденилированной формы фермента,
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]