Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
61
На мутантах, дефектных по одному из ферментов биосинтеза
аргинина, путем опытов в хемостате удалось показать, что состояние
дерепрессии может сохраняться: если рост клеток лимитируется аргинином,
активность фермента в 25 раз выше «обычного» уровня.
Все биосинтетические пути находятся под контролем механизма
репрессии конечным продуктом. Точно так же образование большинства
анаболических ферментов регулируется путем репрессии их синтеза.
Репрессия осуществляется особыми присутствующими в клетке веществами
– репрессорами. Факторами, модифицирующими активность репрессоров,
могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также
промежуточные продукты некоторых катаболических или АMРиболических
путей.
Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции
стал проясняться с 50-х гг. Большой вклад в это внесли работы Ф. Жакоба и
Ж. Моно.
Учитывая это, репрессию ферментов можно представить таким
образом: когда продукт метаболического пути накапливается в клетках, он
взаимодействует с белком-репрессором с образованием активного
репрессора. Последний присоединяется к опреаторному участку и подавляет
транскрипцию оперона.
Время полужизни мРНК непродолжительно, поэтому конечный
продукт останавливает синтез фермента лишь на короткое время. Сам по
себе конечный продукт является корепрессором не при всех анаболических
превращениях. При биосинтезе некоторых аминокислот, например гистидина
или валина, корепрессором служит производное тРНК. Следует также
отметить, что объединение генов, ответственных за синтез ферментов
анаболизма, в кластеры не являются непременным условием для регуляции
конечным продуктом. В клетках E.coli гены, кодирующие ферменты
биосинтеза аргинина, занимают различные участки в хромосоме; все они
62
выключаются одним и тем же комплексом репрессор-аргинин, то есть они не
образуют оперон.
Регуляция синтеза ферментов путем репрессии конечным продуктом
оказывается более сложной и в случае разветвленных путей анаболизма. В
таком случае, если бы ни один из конечных продуктов полностью подавлял
образование ферментов, участвующих также в синтезе других мономеров, то
это могло бы привести к недостатку необходимых соединений в задержке
роста клеток. При изучении регуляции синтеза ферментов разветвленных
метаболических путей обнаружено, что существует два механизма,
помогающие преодолевать вышеуказанные трудности.
Первый связан с наличием изоферментов, которые для общих реакций
синтезируются так, что каждый продукт имеет «свой» фермент, синтез
которого может быть репрессирован или дерепрессирован. В клетках E.coli
имеются три аспартаткиназы и две гомосериндегидрогеназы, а синтез этих
ферментов находится под контролем разных конечных продуктов. Второй
механизм основан на том, что для репрессии синтеза ферментов необходимо,
чтобы все продукты, синтезируемые этими ферментами, находились в
избытке. Такой вид репрессии называется мультивалентной репрессией, ди-
или тривалентной репрессией, если в ней случайно участвуют два или три
продукта.
3.3.1 Trp-оперон E.coli
Рассмотрим триптофановый оперон, как пример регуляции обмена
веществ на уровне репрессии конечным продуктом. У прокариот пять генов
(e, d, c, b, a), кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют
оперон (рисунок 25). Они кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе
триптофана – одной из незаменимых аминокислот, по мере увеличения
63
концентрации триптофана наступает момент, когда его дальнейший синтез
становится нежелательным и транскрипция прекращается.
Рисунок 25 – Трипрофановый оперон E.coli
Синтез триптофана в Е.соli происходит из ароматического
предшественника – хоризмовой кислоты – в ходе пяти последовательных
реакций, катализируемых ферментным комплексом из пяти белков.
Образование этих кодируемых trp-опероном белков происходит в результате
трансляции полицистронной мРНК длиной 7000 нуклеотидов,
транскрибируемой с промотора примерно в равных количествах и
согласованно. Наличие в среде достаточного для роста бактерий количества
триптофана клетки Е.coli начинают образовывать ферменты для биосинтеза
триптофана в очень следовых количествах. Однако если клетки будут
лишены экзогенного триптофана, то будет происходить довольно
интенсивный синтез всего ферментного комплекса из пяти белков. При этом
в зависимости от внутриклеточного уровня триптофана существуют различия
содержания ферментов этой группы до 700 раз у бактерий E.coli.
Данное обстоятельство в разбросе уровня экспрессии у клеток E.coli
обусловлен наличием двух практически независимых механизмов регуляции,
каждый из которых будет «подгонять» уровень синтеза trp-иРНК к
концентрации внутриклеточного триптофана. Эффекты этих двух
64
регуляторных механизмов комплементарны, мультипликативны и позволяют
увеличивать степень экспрессии оперона.
Первый механизм основан на репрессии, изменяющей эффективность
инициации транскрипции в промоторе, то есть на репрессии конечным
продуктом.
Рисунок 26 – Принцип работы триптофанового оперона E.coli
Ген trpR, кодирующий репрессорный белок молекулярной массой 58
кДа, находится далеко от trp-оперона. Ген-регулятор обеспечивает синтез
аллостерического белка – триптофанового репрессора, не активного в
свободном состоянии (рисунок 26). Репрессор в таком виде не связывается с
65
операторным участком и, следовательно, не может препятствовать началу
транскрипции. Когда конечный продукт метаболического пути (триптофан)
накапливается выше определенного уровня, он взаимодействует с
репрессором и активирует его.
Поскольку уровень экспрессии trpR очень низок и не зависит от
триптофана, концентрация активного репрессора отражает концентрацию
внутриклеточного триптофана. При присоединении триптофана к данному
репрессору происходят конформационные изменения репрессора,
приводящие его в активное состояние (рисунок 27). Трехмерная структура
этого бактериального белка (спираль-виток-спираль) определена с помощью
метода рассеивания рентгеновских лучей и показана как в случае связывания
триптофана, так и без него.
А Б
Рисунок 27 – Димер белка-репрессора трипрофанового оперона: А –
без триптофана; Б – с триптофаном
Конформационные изменения дают возможность этому
регуляторному белку тесно связываться со специфической
66
последовательностью ДНК (рисунок 28А), и, таким образом, блокировать
транскрипцию генов, которые кодируют белки, участвующие в синтезе
триптофана (trp-оперон). Связывание триптофана приводит к увеличению
расстояния между двумя узнающими спиралями в димере, что способствует
образованию симметрично расположенных водородных связей.
А Б
Рисунок 28 – Соединение триптофана с белком-репрессором
триптофанового оперона изменяет конформацию репрессора: А – в
присутствии триптофана; Б – в отсутствии триптофана
В результате таких конформационных изменений активированный
репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет
транскрипцию триптофанового оперона. Нуклеотидные последовательности
trp-оператора и промотора перекрываются, поэтому связывание комплекса
репрессор-триптофан с оператором препятствует правильному
взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. При этих условиях
67
транскрипция оперона не осуществляется и ферменты биосинтеза не
образуются (рисунок 28Б). В отсутствие триптофана не происходит и
связывания репрессора с оператором, что позволяет РНК-полимеразе без
помех инициировать транскрипцию на промоторе и синтезировать мРНК.
Опероны, управляющие синтезом аргинина, гистидина или триптофана,
являются репрессибельными, то есть максимальная частота транскрипции
достигается только при отсутствии в клетке соответствующих
низкомолекулярных эффекторов – аргинина, гистидина и триптофана (или в
том случае, если их концентрация, ниже критического порогового уровня).
Такие эффекторы называют корепрессорами, а соответствующие
регуляторные белки – белками-репрессорами или апорепрессорами. Синтез
ферментов репрессибельного оперона включается посредством дерепрессии.
Регуляторный белок, который связывается с ДНК в отсутствие эффектора
(индуктора), называют репрессором.
Второй регуляторный механизм, определяющий уровень синтеза trp-
мРНК называется аттенуацией и регулирует транскрипцию с помощью
сигнала терминации транскрипции, расположенного между промотором и
началом первого структурного гена.
3.3.2 Аттенуация
Механизм аттенуации характерен как для регуляции экспрессии
многих генов и оперонов у Е.соli, так и у других организмов. Например,
экспрессия оперона, состоящего их девяти ферментов, участвующих в
биосинтезе гистидина, происходит исключительно путем регуляции
механизмом аттенуации. Аттенуатором будет служить полипептид-
кодирующая последовательность с шестью тандемными гистидиновыми
кодонами. У оперонов, экспрессия которых будет зависеть от наличия
определенных аминокислот, например треонина и изолейцина (или лейцина),
68
валина и изолейцина, лидерный участок – полипептид-кодирующая
последовательность – буквально богата кодонами для этих аминокислот. При
этом антитерминация, то есть ослабленная терминация, не будет требовать
сопряжения трансляции и транскрипции и ее осуществление будет зависеть
от некоторых белков, допускающих экспрессию особых кластеров генов
только после того, как будет произведен синтез белков, способствующих
аттенуации.
Аттенуация – широко распространенное явление, встречающееся в
шести на сегодняшний день известных оперонах биосинтеза аминокислот.
Следует заметить, что формально в случае аттенуации рибосому можно
считать активатором транскрипции, а аминоацил-тРНК – корепрессором.
Регуляция работы триптофанового оперона с помощью аттенуации
осуществляется при участии лидероной последовательности нуклеотидов,
находящейся на расстоянии примерно 100-140 пар оснований от начала
транскрипции, между промоторной областью и первым структурным геном.
Этот так называемый лидерный сегмент, trpL, содержит аттенуаторную
последовательность, которая вынуждает РНК-полимеразу прервать
транскрипцию как раз перед началом trpЕ-гена с отделением фрагмента РНК
длиной 141 нуклеотид-trp-лидерной мРНК. За лидерным пептидом
располагается шпилечная структура, являющаяся терминатором, на котором
в условиях избытка триптофана транскрипция оперона заканчивается, не
достигнув структурных генов. Лидерный же пептид богат триптофановыми
кодонами. И при уровнях триптофана выше среднего происходит
терминация. Блокировка же терминации транскрипции в пределах
аттенуаторной последовательности будет блокироваться в значительной
степени при низком уровне триптофана а сама транскрипция будет
проходить через терминатор с образованием полноразмерной мРНК trpоперона.
69
А
Б
Рисунок 29 – Варианты образования шпилек при аттенуации trpоперона E.coli:
А – ρ-независимая терминация транскрипции на участке из
нескольких расположенных подряд за четвертым сегментом остатков
урацила; Б – прохождение транскрипции обеспечивается одноцепочечными
сегментами 1 и 4
Механизм регуляции терминации транскрипции в аттенуаторном
участке с помощью изменения количества триптофана в среде был выснен,
когда стала ясна нуклеотидная последовательность аттенуатора и
установлено, что на аттенуацию оказывает влияние трансляция, идущая
одновременно с транскрипцией. Было выяснено, что участок из первых 145
нуклеотидов транскрипта триптофанового оперона содержит необычные по
нуклеотидной последовательности сегмента. Первый из них кодирует
короткую полипептидную цепь из 14 аминокислот, две из которых являются
70
тандемными триптофановыми остатками. Два других сегмента с своем
составе имеют инвертированные повторы, из-за которых возможно
образование внутримолекулярных спариваний оснований РНК-транскрипта и
формирование двух альтернативных шпилечных структур. Одна из этих
структур, формируемая в результате спаривания сегментов 1 и 2, 3 и 4
соответственно, опосредствует ρ-независимую терминацию транскрипции на
участке, состоящем из нескольких расположенных подряд за четвертым
сегментом остатков урацила. Другая шпилечная структура, в которой
происходит спаривание только сегментов 2 и 3, а сегменты 1 и 4 не
спариваются и остаются одноцепочечными, будет разрешать транскрипцию и
РНК-полимераза может дойти до конца триптофанового оперона (рисунок
29).
Образование той или иной шпилечной структуры при транскрипции
аттенуаторного участка будет зависеть от того, транслируется ли рибосомами
полная последовательность, которая кодирует полипептид длиной 14
аминокислот. Так если при синтезе лидерного полипептида будет
происходить инициация в кодоне AUG, то рибосомы будут транслировать
следующие 13 кодонов при наличии в клетке всех необходимых аминоацилтРНК. При недостатке же триптофанил-тРНК рибосомы будут
останавливаться, доходя до тандемных триптофановых кодонов. Если
остановка рибосомы произойдет в одном из триптофановых кодонов,
которые расположены в аттенуаторном сегменте 1, то последовательности
сегментов 2 и 3 смогут свободно спариваться и образовывать шпилечную
структуру, а сегмент 4 будет оставаться одноцепочечным. Эта структура
приведет к образованию полноразмерной триптофанил-мРНК длиной 7000
нуклеотидов. Если же триптофанил-тРНК имеется в количестве, достаточном
для трансляции тандемных триптофановых кодонов, то рибосомы будут
двигаться до терминаторного кодона лидерного пептида, сегмент 2 будет
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]