Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
91
биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции:
Lux I
Lux R
Lux CDABEG
Pl
Pr
+
CRP
cAMP
-
+
Lux R
Lux I
AI
при малых концентрациях наблюдается отсутствие свечения (лаг-период), а
при достижении популяцией критической плотности (кворума) резкое
усиление свечения.
Рисунок 35 – Схема регуляции экспрессии lux-оперона E.coli
У большинства светящихся бактерий интенсивность люминесценции
четко зависит от плотности клеток в культуре: свечение густых культур
может в 1000 раз превышать свечение разбавленных культур в расчете на
клетку. Исследование данного эффекта у симбиотической бактерии Vibrio
fischeri показало, что регуляция свечения, которая зависит от плотности
клеток (эффект «кворум сенсинг»), происходит на уровне транскрипции.
Клетки V.fischeri конститутивно синтезируют и выделяют в среду
небольшое количество сигнального соединения – аутоиндуктора. По-
видимому, он накапливается в среде пропорционально скорости роста и
92
плотности бактерий. При достижении высокой плотности клеток достигается
и пороговая концентрация аутоиндуктора, при которой он способен
индуцировать люминесценцию.
Аутоиндуктор, легко проникая через клеточную стенку, связывается в
клетках со своим рецептором LuxR, регулятором транскрипции,
активирующий в этих условиях экспрессию luxGDABEGH генов.
Именно поэтому в морской воде плотность клеток V.fischeri обычно
не превышает 100 клеток в миллилитре, и они не светятся, но при
достижении популяцией более высокой плотности (выше 105 клеток/мл), что
происходит при росте культуры в богатых лабораторных средах или в
светящихся органах (фотофорах) у различных рыб, морских животных,
головоногих моллюсков (природная экологическая ниша для этого вида
морских бактерий-симбионтов), начинается экспрессия генов lux-оперона,
приводящая к резкому возрастанию свечения.
Симбиоз морских животных с люминесцирующими бактериями
взаимовыгоден. В фотофорах бактерии обеспечиваются питательной средой
и достигают концентрации порядка 105 клеток/мл. Свечение головоногих
моллюсков Euprymna scolopes обеспечивает им сравнительную безопасность,
что предохраняет их от атаки хищников из глубин океана, так как свечение
сходно с лунным светом и в результате этого тело моллюска теряет тень.
По названию ключевых регуляторных генов luxI и luxR lux-регулона
V.fischeri в настоящее время все подобные системы относят к механизму
регуляции типа «luxI-luxR».
В качестве другого примера использования сигнальных молекул
гомосеринлактонов можно рассматривать патогена для животных
Pseudomonas aeruginosa. Синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa
обладает большим числом факторов вирулентности, в отличие от
многочисленных представителей своего рода. Способность к инвазии и
персистенции в тканях, а также способность к цитотоксическому эффекту и
93
стимуляции генерализованной воспалительной реакции определяют
патогенность синегнойной палочки.
Один из механизмов, определяющих экспрессию факторов
вирулентности, характерный для синегнойной палочки является феномен
кооперативной чувствительности («Quorum sensing»). Суть данного
механизма сводится к тому, что при изменении численности бактерий и за
счет продукции аутоиндукторов – внеклеточных сигнальных молекул, а
также их детекции и формирования ответной реакции нового качества
происходит модификация физиологических функций Pseudomonas
aeruginosa. Именно под контролем такой системы происходит синтез всех
экзотоксинов, а также образование биопленки. При этом выраженное
снижение вирулентности у Р.aeruginosa как раз и происходит при блокаде
механизмов реализации феномена кооперативной чувствительности.
Патогенность у Р.aeruginosa обусловлена широким арсеналом
факторов вирулентности. Одни из них ассоциированы с клеткой
(липополисахариды, пили, адгезины),а другие секретируются наружу
(экзотоксин А, протеазы, экзофермент S, антибиотик пиоцианин,
рамнолипиды и т. д.).
Большинство из этих факторов вирулентности приводят к секреции
фактора некроза опухоли (TNF), ключевого провоспалительного медиатора,
наряду с этим, фосфолипаза способствует либерации IL-1; IL-6; γинтерферона из моноцитов, Т-лимфоцитов и полиморфноядерных
нейтрофилов. Как и у других грамотрицательных бактерий, у Р.aeruginosa
описана система экскреции III типа (своеобразный «молекулярный шприц»),
которая обеспечивает выведение из внутренней среды бактериальной клетки
экзоэнзимов и последующую их транслокацию внутрь эукариотической
клетки, непосредственно к мишеням. К выделяемым данной системой
веществам у синегнойной палочки относятся такие экзотоксины как ExoS;
ExoT; ExoY; ExoU.
94
Системами межклеточного взаимодействия контролируется
образование многих из внеклеточных факторов вирулентности.
Центральными компонентами такого взаимодействия служат las- и rhlсистемы кворум-сенсинга, которые в зависимости от величины плотности
клеток микроорганизма активируют экспрессию генов. Каждая из этих
систем представлена двумя генами: один ген кодирует фермент,
ответственный за синтез специфического аутоиндуктора – ацилированного
гомосеринлактона (lasl/rhll); другой ген кодирует активатор транскрипции, с
которым будет связываться соответствующий аутоиндуктор (lasR/rhIR).
Аутоиндуктором систем las и rhi является N-(3-оксододеканоил)-Lгомосеринлактон (З-оксо-С12-HSL), для экспорта которого из клетки служит
специальная система, получившая название MexEF-OprN-помпа и Nбутирил-L-гомосеринлактон (C4-HSL) соответственно.
Система las ответственна за контроль экспрессии генов, кодирующих
три фактора вирулентности – эластазы А, В и щелочную протеазу; система
rhi контролирует экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза
рамнолипидов, пиоцианина. Не очень давно обнаружили третью сигнальную
молекулу, принимающую участие в реакциях феномена кооперативной
чувствительности у P.aeruginosa – 2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон (PQS).
Эта сигнальная молекула ответственна за контроль уровня экспрессии las В,
кодирующего эластазу Las В, а также уровеня экспрессии rhil, кодирующего
синтетазу C4-HSL.
Ингибиция синтеза ДНК, изменение клеточной формы, потеря
способности к локальной адгезии, стимуляция апоптоза – это
непосредственные клеточные эффекты, происходящие под действием
экзотоксинов. С позиций способности к синтезу и секреции факторов
токсичности, популяции Рseudomonas aeruginosa гетерогенны, так как
различные штаммы этого микроорганизма обладают различной
токсичностью. По-видимому, существенное влияние на экспрессию факторов
95
вирулентности оказывают влияние изменение условий внешней среды,
плотности бактериальной популяции, а также процесс индивидуального
взаимодействия макроорганизма и бактерий.
P.aeruginosa обладает способностью к неспецифической адгезии на
имлантируемых устройствах (эндотрахеальные трубки,катетеры и др.). Со
временем микроколонии бактерий объединяются в сплошную биопленку,
представляющую из себя несколько слоев микробных клеток, покрытые
общим гликокаликсом – полимером полисахаридной природы. Находясь в
состоянии покоя, подавляющее большинство клеток характеризуется крайне
низкой чувствительностью к воздействию антибиотиков. Источником
выделения в окружающую среду свободных микробных клеток служат
периодически возникающие очаги спонтанного размножения. Данный
процесс, прежде всего, лежит в основе катетер-ассоциированных инфекций.
Особенную трудность представляет повышенная лекарственная устойчивость
бактерий в биопленках. Бактерии часто используют реакции кворум-сенсинга
для синтеза антибиотиков, факторов вирулентности и формирования
биопленок, поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые
возможности для предупреждения и лечения болезней, которые вызываются
микробными агентами, а также позволяет по-новому взглянуть на сложный
комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах
обитания микроорганизмов.
Бактерии рода Erwinia (E.chrysanthemii, E.carotovora), патогенные для
растений, с помощью целлюлаз и пектиназ расщепляют клеточные стенки
растений. Образование этих ферментов также зависит от плотности
популяции и является одним из важных факторов вирулентности. В этом
случае у Erwinia будет функционировать генная система expI-expR,
аналогичная системе luxI-luxR у V.fisсheri. Также в реакциях кворум-
сенсинга будет задействована регуляторная система, которая обеспечивается
транскрипцией генов rsmA-rsmB. Также от плотности популяции
96
бактериальных клеток у E.carotovora зависит синтез антибиотика
карбапенема, продукция которого находится под контролем кластера генов
сагА-сагН, и, предполагается, что данный антибиотик задействован в
устранении в локусе заражения растения конкурирующих микроорганизмов.
Бактерия Agrobacterium tumefaciens также является патогеном
растений и вызывает образование корончатых галлов у многих видов
растений, представляющих собой растительный аналог злокачественной
опухоли и образующихся в результате переноса от бактерии в ядро
растительной клетки онкогенных фрагментов ДНК с помощью Ti-плазмид. В
Ti-плазмидах есть гены, обуславливающие синтез опинов растительными
клетками, служащих питательным субстратом для A.tumefaciens. Генная
система traI-traR, гомологичная luxI-luxR, приводит к распространению Ti-
плазмид в популяции бактерий. Плазмидная ДНК стремится
распространиться в бактериальной популяции и побуждает клетки, несущие
Ti-плазмиду конъюгировать с другими бактериальными клетками при
достижении достаточного «кворума». Конъюгативный перенос Ti-плазмид
будет зависеть от опинов, так, например, транскрипция traR стимулируется
фактором OccR, который активируется октопином.
4.3 «Quorum sensing» в многоклеточных образованиях
Системы «quorum sensing» играют немаловажную роль не только при
взаимодействии бактерий друг с другом, но и в процессах взаимодействия
бактерий с растительными и животными клетками.
Способность бактерий образовывать биопленки интересна тем, что
при росте бактериальных клеток в биопленках представители патогенных для
животных и человека возбудителей проявляют устойчивость к действию
различных антимикробных веществ. Биопленки представляют собой
высокоупорядоченные бактериальные сообщества, позволяющие бактериям
97
жить в прикрепленном состоянии. Благодаря тому, что биопленку
пронизывает сеть водных каналов, происходит обеспечение доставки
питательных веществ всем членам сообщества и удаление продуктов
метаболизма, причем биопленки в своем составе могут иметь не один, а
нескольких видов бактерий. В одной биопленке также наблюдаются
различные образцы генной экспрессии, что говорит в пользу того, что
индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности»,
которые, комбинируясь с другими, могут усиливать жизнеспособность всего
консорциума.
Патогенный микроорганизм P.aeruginosa формирует биопленки в
легких, толщиной всего в несколько сотен микрометров. В зрелой биопленке
микроколонии располагаются во внеклеточном полисахаридном матриксе.
Причем благодаря кислородному градиенту, то есть уменьшении
концентрации кислорода от периферии вглубь внутри биопленки
обнаруживается неоднородность. Также предполагается, что сходные
градиенты будут наблюдаться для рН и питательных веществ,
обеспечивающие физиологическую вариабельность среди индивидуальных
клеток биопленки. Благодаря этому глубине биопленки клетки будут расти
гораздо медленнее, чем на периферии. Бактерии в такой зрелой биопленке
фенотипически устойчивы к бактерицидным агентам и в связи с этим,
биопленки вызывают различные типы хронических бактериальных
инфекций. У P.aeruginosa формирование биопленки находится под
контролем реакций системы «кворум-сенсинг». Так как белок LasI не
синтезирует 3-oкco-C12-HSL, а при его наличии в среде происходит
нарушение созревания биопленки и после стадии микроколонии
формирование микропленки не продолжается, то мутации гена lasI,
кодирующего данный белок LasI. В процессах формирования биопленки роль
же C4-HSL остается неизвестной. В результате этого биопленки, которые
образуются мутантами по LasI-белку, восприимчивы к детергентам, в то
98
время как нормальные биопленки к ним устойчивы. Это дает возможность
предполагать, что терапия, направленная на нарушение регуляции механизма
кворум-сенсинга у P.aeruginosa, будет приводить к остановке формирования
биопленки, что повысит чувствительность данных бактерий к
антимикробным агентам.
У патогенной бактерии Burkholderia cepacia формирование биопленки
также определяется «чувством кворума». При росте в биопленках
Burkholderia cepacia подобно P.aeruginosa обнаруживает значительную
устойчивость к антимикробным агентам.
4.4 Межвидовые взаимодействия микроорганизмов
У бактерий для синхронизации специализированных функций видов
в группе могут служить межвидовые коммуникации. Разнообразие, которое
присутствует в каждой данной популяции будет приводить к повышению
выживаемости для всего сообщества. Помимо этого, на основе кворум-
сенсинга продуктивные взаимодействия способствуют развитию
многовидовых бактериальных организаций, в частности биопленок и
установлению с хозяевами-эукариотами специфических симбиотических
ассоциаций.
Микробные сообщества ротовой полости и поверхности зубов
человека в качестве примера межвидовых взаимоотношений
микроорганизмов наиболее полно изучены. Так в биопленках на поверхности
зубов выявлено около 500 видов бактерий, функционирующих как
координированное сообщество и имеющее внутри- и межвидовые
коммуникации. От 60 до 90 % бактерий, колонизирующих поверхность
зубов в течение первых четырех часов после ее очистки стоматологом,
составляют стрептококки. Среди других видов «ранних колонизаторов»
99
обнаруживаются представители Eikenella, Actinomyces, Prevotella,
Capnocytophaga, Haemophilus, Veillonella и Propionibacterium.
Если рассматривать генетически идентичные клетки, то, по всей
вероятности, способы коммуникаций будут отличаться от сигналов при
межвидовых коммуникациях. До сих пор нет доказательств, что среди
сигнальных молекул бактерий ротовой полости встречаются типичные
представители семейства ацилгомосеринлактонов, регулирующие у
грамотрицательных бактерий внутривидовую генную экспрессию.
Автоиндуктор-2 (AI-2) – главная сигнальная молекула при
межвидовых коммуникациях, подтверждением этому является факт
обнаружения гена luxS у нескольких родов бактерий ротовой полости,
кодирующий фермент, который необходим для синтеза молекулы AI-2.
Впервые молекулы AI-2 были обнаружены у морской светящейся
бактерии Vibrio harveyi и являлись сигнальными молекулами, которые
регулируют процесс биолюминесценции. Позже, более чем у 30 видов
бактерий, в том числе у грамположительных и грамотрицательных
микроорганизмов, было показано наличие AI-2.
В некоторых случаях оказывается полезным, когда одна группа
бактерий может оказывать негативный эффект на цикл реакций кворум-
сенсинга конкурирующей группы бактерий. Исследования в этой области
показывают несколько примеров использования сосуществующими
популяциями стратегий антикворум-сенсинга. Так, например, Staphylococcus
epidermidis использует пептид не только для контроля уровня своей agr
вирулентности, но и для подавления вирулентности у Staphylococcus aureus.
Штамм Bacillus sp. 240B1 показывает способность к энзиматической
инактивации ацилгомосеринлактонов, являющихся сигнальными молекулами
грамотрицательных бактерий. Было продемонстрировано, что в присутствии
автоиндуктора, гомосеринлактоназы, которая состоит из 250 аминокислот,
происходит разрушение молекул гомосеринлактонов, продуцируемых
100
патогеном растений Erwinia сагоtovora. Гены, гомологичные гену аiiА, были
обнаружены и у 16 подвидов Bacillus thuringiensis, что говорит в пользу того,
что и эти микроорганизмы обладают способностью осуществлять
деградацию гомосеринлактонов.
Почвенная бактерия Variovorax paradoxus в качестве единственного
источника углерода и азота может использовать ацилгомосеринлактоны, что
говорит в пользу того, что V.paradoxus, в своих природных местах обитания,
может расти на ацилгомосеринлактонах, тем самым извлекая выгоду из
конкурентного обострения в окружающей среде. В этом случае фермент,
который разрушает ацилгомосеринлактоны, отличен от AiiA-лактоназы и
представляет собой аминоацилазу, которая отщепляет лактонное кольцо от
ацильной группы.
В силу того, что у многих патогенов растений и животных системы
кворум-сенсинга контролируют вирулентность, то их возможно
рассматривать как потенциальные мишени для действия антимикробных
агентов. Во-первых, одна из стратегий состоит в ингибировании синтеза
самих ацилгомосеринлактонов или молекул-предшественников
ацилгомосеринлактонов. Во-вторых, мишенью для лекарственных
препаратов могут служить системы, которые контролируют выброс и
диффузию ацилгомосеринлактонов. В-третьих, за связывание с гомологами
LuxR ацилгомосеринлактон-подобные антагонисты могут конкурировать с
самими ацилгомосеринлактонами. В-четвертых, возможно применение
ферментов, которые расщепляют эти ацилгомосеринлактоны и антител к
этим молекулам. И, наконец, в-пятых, как было показано недавно, гены аiiА,
которые кодируют лактоназы, которые осуществляют деградацию
ацилгомосеринлактонов, могут быть внедрены в геном растений, где
экспрессируясь, они могли бы обеспечивать защиту от патогенных
микроорганизмов растению-хозяину. Так, например, успешно противостояли
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]