Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
51
снижая его сродство к гену-оператору). Структурные гены выходят из-под
запрещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК.
А
Б
Рисунок 20 – Отрицательный контроль в работе лактозного оперона:
А – в отсутствии лактозы, Б – в присутствии лактозы
Лактозный оперон подвержен также второму контролю –
положительному (рисунок 21). Это означает, что транскрипция происходит
52
лишь тогда, когда с промотором связан второй регуляторный белок – САР,
или CRP. Сокращения CAP (catabolite activator protein) и CRP (cyclic AMP
receptor protein) – синонимы. Таким образом вторая часть промотора
представляет собой участок связывания белка, активирующего катаболитный
ген САР, связанного с цАMР (циклическим АMР). При этом вхождение РНКполимеразы в участок связывания возможно только в том случае, если САРучасток будет занят. Данная ситуация возможна лишь тогда, когда в среде
нет глюкозы. В этом случае в среде происходит нарастание количества
цАMР («сигнала голода») и образование комплекса между цАMР и САРбелком. Соединение этого комплекса со вторым участком промотора и дает
возможность ферменту РНК-полимеразе сесть на участок первоначального
связывания, «спуститься» к инициирующему кодону и начать транскрипцию
трех структурных генов. Присутствие же в среде лактозы приводит к
открытию операторного участка транскрипции самого лактозного оперона.
В этом, как и во всех, случаях, цАMР функционирует в качестве
эффектора, который будет образовывать комплекс с аллостерическим белком
– катаболитным активатором, который не активный в свободном состоянии.
Данный комплекс, присоединяясь к промотору в определенном участке будет
обеспечивать возможность связывания с промотором РНК-полимеразы и,
следовательно, инициацию транскрипции. Концентрация цАMР также будет
определять количество образующегося комплекса и уменьшаться при
увеличении содержания глюкозы в среде. В результате глюкоза вызывает
изменение внутриклеточной концентрации цАMР.
Таким образом (рисунок 22) если в клетке имеется только глюкоза,
тогда белок-репрессор присоединен к оператору, а РНК-полимераза не может
присоединиться к промотору. Оперон не работает, структурные гены
выключены.
53
Рисунок 21 – Положительный контроль в работе лактозного оперона
E.coli
Наличие в среде глюкозы и появление лактозы приводит к
отщеплению белка-репрессора от оператора и открытию пути для РНК-
полимеразы. Однако наличие в клетке глюкозы приводит к блокировке
синтеза цАМР, что в свою очередь препятствует возможности РНК-
полимеразы не может присоединиться к промотору. В результате
структурные гены продолжают быть выключены и оперон по-прежнему не
работает.
54
Рисунок 22 – Основные принципы работы лактозного оперона E.coli
при наличии в среде различных субстратов
55
Присутствие в клетке только лактозы приводит к связыванию ее с
белком-репрессором, его отщеплением от молекулы ДНК и открытию пути
РНК-полимеразе. При этом отсутствие глюкозы приводит к тому, что белок
САР катализирует синтез цАMР, и РНК-полимераза имеет возможность
присоединиться к промотору, синтезировать иРНК, с которой и будет
происходить трансляция ферментов, обеспечивающих сбраживание лактозы.
Таким образом, лактозный оперон подвержен двойному контролю –
индуктора (лактозы) и репрессора (глюкозы).
3.2.3 Ara-оперон E.coli
Арабинозный оперон Е. coli подвержен положительной регуляции, так
же как рамнозный и мальтозный опероны, при этом он является примером
системы с более сложным контролем, чем лактозный, который можно
считать примером «простой» регуляции. Хотя в случае lac-оперона
действуют два белка-регулятора, а именно осуществляющий негативный
контроль репрессор LacI и активатор транскрипции САР, действие этих
белков друг от друга не зависит, и мы фактически имеем две простых
регуляторных системы. В ara опероне один и тот же белок (продукт гена
araC) может выполнять как репрессорную, так и активаторную функции.
Всего за утилизацию арабинозы отвечает 6 генов – пять структурных
и один регуляторный (araC) (рисунок 23). Три гена образуют оперон,
araBAD, который и регулируется продуктом гена araC. Ген araC
располагается перед опероном araBAD, но отделен от него 147 парами
оснований и считывается в противоположном направлении.
Еще два гена, araE и araF не сцеплены ни друг с другом, ни с
кластером araCBAD, то есть располагаются в совершенно другом районе
хромосомы. Тем не менее, эти два гена подвержены той же системе
регуляции и в их промоторной области имеются сайты связывания продукта
56
araC. Такая организация называется регулоном. Иными словами, регулон –
группа генов и (или) оперонов, как правило, необходимых для выполнения
одной физиологической функции, не сцепленных между собой, но
находящихся под общим контролем.
Генетическое изучение арабинозного оперона указывало на то, что ген
araC должен кодировать как репрессор, так и активатор транскрипции.
Оказалось, что непосредственно продукт является репрессором, но
присоединение индуктора (арабинозы) не только инактивирует репрессор, но
и превращает его в индуктор. Эти две формы продукта araC называются
соответственно Crep и Cind. Две формы белка C имеют разные сайты
связывания в области между генами araC и araB. Кроме того, в этой же
области располагается сайт связывания САР и, конечно же, промоторы гена
araC и оперона araBAD. Эта область ДНК организована таким образом, что
сайт связывания САР располагается между двумя промоторами, причем
связывание комплекса САР-цАMР необходимо для инициации транскрипции
в обоих направлениях. Сайт связывания Crep перекрывается с промотором
гена araC, поэтому связывание Crep ингибирует транскрипцию своего
собственного гена. Таким образом, в отсутствие индуктора транскрипция
гена araC поддерживается на очень низком базальном уровне, достаточном
только для обеспечения собственной репрессии. Появление индуктора
(арабинозы) вызывает отсоединение репрессора и связывание его с
активаторным сайтом, располагающимся между сайтом связывания САР и
промотором оперона araBAD, что приводит к снятию репрессии с araC и
обеспечивает синтез больших количеств его продукта, который, связываясь с
арабинозой, активирует транскрипцию оперона araBAD. Таким образом, в
случае транскрипции «влево» мы имеем точную копию модели регуляции lac
оперона. Репрессор Crep ингибирует транскрипцию araC фактически так же,
как LacI ингибирует транскрипцию lac-оперона. И точно так же добавление
индуктора, в данном случае арабинозы, снимает репрессию.
57
ДНК
Регуляторный белок-
репрессор
Арабинозоизомераза
Рибонуклеаза
Рибоза-5-фосфатэпимераза
мРНК
мРНК
Регуляторный белок-
репрессор
Арабинозоизомераза
Рибонуклеаза
Рибоза-5-фосфатэпимераза
ДНК
мРНК
мРНК
Регуляторный белок-
репрессор
Арабинозоизомераза
Рибонуклеаза
Рибоза-5-фосфатэпимераза
Рисунок 23 – Принцип работы арабинозного оперона E.coli
Также аналогично действует и активирующий комплекс САР-цАMР
по отношению к транскрипции «влево». Однако, в случае транскрипции
«вправо» ситуация более сложная, поскольку здесь действуют уже два
активаторных белка, тот же САР-цАMР и Cind. Сайт связывания Cind
расположен таким образом, что, связавшись с ДНК, этот белок может
непосредственно контактировать с РНК-полимеразой, что и вызывает
активацию транскрипции. Но поскольку сайт связывания Cind расположен
между промотором и САР-связывающим сайтом, комплекс САР-цАMР
располагается слишком далеко, чтобы непосредственно контактировать с
РНК-полимеразой, собирающейся читать «вправо». В этом случае САР имеет
два типа расположения относительно промотора. Первый – стандартный для
активаторов транскрипции – прямо перед промотором (например, в
положении -72...- 50 у lac оперона или -50...-23 у gal оперона), что позволяет
белку непосредственно контактировать с РНК-полимеразой. Но у многих
58
промоторов сайт связывания САР располагается значительно дальше. В
случае ara оперона САР связывается в положении -107...-78. Есть и другие
опероны с удаленным расположением САР-связывающего сайта.
При этом, вопрос о том, как действует САР, остается открытым и
выдвинуто две модели, объясняющие принцип его действия. Первая
объясняет действие САР через белковые взаимодействия. В принципе, даже
не очень сильное взаимодействие между двумя белками может оказаться
достаточным для существенного усиления связи РНК-полимеразы с
промотором. Проблемой здесь является то, что даже в случае gal и lac
промоторов взаимодействие должно происходить по-разному, а в случае ara
промотора должны взаимодействовать три белка. Вторая модель
предполагает, что эффект САР определяется целиком его связыванием с
ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза не может сама
обеспечить первоначальное плавление ДНК в области промотора, в пользу
чего говорит тот факт, что ни один из САР-зависимых промоторов не имеет
«хорошей», то есть близкой к канонической, -35 последовательности.
Экспериментально установлено, что связывание белка САР с ДНК вносит в
нее изгиб почти под прямым углом, что возможно только в случае серьезного
изменения структуры ДНК в этом районе. Предполагается, что это изменение
структуры облегчает плавление ДНК в промоторной области и,
следовательно, инициацию транскрипции.
3.3 Репрессия конечным продуктом
Если в среду добавить вещество, служащее субстратом определенного
фермента, происходит быстрый синтез этого фермента в клетке, т. е. имеет
место индукция синтеза фермента. Если же в питательной среде в готовом
виде содержится вещество, являющееся конечным продуктом какого-либо
биосинтетического пути, происходит быстрое прекращение синтеза
59
ферментов этого пути. Это явление получило название репрессии конечным
орнитин +
карбамоилфосфат
цитруллин
аргинин
Репрессия конечным продуктом
ОКТаза
продуктом.
Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут
быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза превысит обычную, если
концентрация конечного продукта упадет до очень низкого уровня.
Дерепрессия этих ферментов аналогична явлению индукции.
При росте клеток E.соli на минимальной среде с глюкозой в качестве
источника углерода и энергии все мономеры, необходимые для образования
макромолекул, синтезируются в соответствии с метаболическими путями.
Для синтеза полимеров требуются строго определенные количества
аминокислот, нуклеотидов и т.д., и избыточного образования мономеров
происходить не должно. Иногда некоторые мономеры поступают в
бактериальные клетки из окружающей среды. Если, например, гистидин или
триптофан присутствуют в среде, то нет необходимости в биосинтезе этих
соединений. Поэтому для экономии энергии у бактерий должны
существовать механизмы, регулирующие содержание анаболических
ферментов. Такое регулирование осуществляется путем репрессии синтеза
анаболического фермента соответствующим конечным продуктом.
Итак, влияние конечного продукта биосинтетического пути на
концентрацию ферментов этого пути можно проиллюстрировать на примере
синтеза аргинина, который синтезируется из глутамата через орнитин,
цитруллин и аргининосукцинат:
При выращивании клеток E.coli на минимальной среде концентрация
одного из ферментов биосинтеза аргинина – орнитин: карбамоилтрансферазы (ОКТазы) – оказывается «обычной» (рисунок 24).
60
Рисунок 24 – Репрессия орнитин:карбамоил-трансферазы (ОКТазы)
При добавлении к минимальной среде аргинина (20 мкг/мл)
образование ОКТазы сразу же прекращается вследствие репрессии. В
результате дальнейшего роста клеток в присутствии аргинина происходит
«разбавление» фермента, и его активность падает до очень низкого уровня.
Если теперь отмыть клетки от аргинина и перенести их в минимальную
среду, не содержащую этой аминокислоты, то сразу же произойдет
дерепрессия и синтез ОКТазы возобновится. Спустя короткое время
концентрация фермента во много раз превысит его содержание в исходной
суспензии клеток.
Если клетки E.coli (дикого типа) выращивать на минимальной
питательной среде в отсутствие аргинина активность этого фермента за
короткое время начинает превышать нормальную, но в дальнейшем в
результате разбавления снижается до нормы. При наличии в среде аргинина
фермент вообще прекращает синтезироваться. Лишь постепенно, после того
как синтез анаболических ферментов приведет к образованию и накоплению
аргинина, активность ОКТазы вновь снизится и достигнет «обычного»
уровня.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]