Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основные механизмы регуляции метаболизма микроорганизмов. Учебное пособие
.pdf
41
активаторами, удаленными на различное расстояние. Естественно, это
возможно, только если активатор контактирует с ДНК с той же стороны, что
и РНК-полимераза. Поэтому CAP может активировать транскрипцию,
связываясь с ДНК в области -61 (как у lac промотора), либо в позициях -71, 81, -91. В этом случае для активации необходима ДНК- связывающая
поверхность, а также некоторые основания, необходимые для
взаимодействия с конкретным активатором. В экспериментах по замещению
αCTD карбокси-концевым доменом репрессора фага λ (cI) было показано, что
такая гибридная cI-α субъединица способна обеспечивать активацию
промотора при взаимодействии с полноразмерным cI на промоторе с сайтом
связывания с cI. Поскольку структура cI совершенно отлична от таковой
αCTD, это свидетельствует о том, что любой дополнительный контакт с
промоторной областью способен усиливать транскрипцию, не изменяя
локальной структуры ДНК.
В случае активаторов, контактирующих с σ70-субъединицей РНКполимеразы (рисунок 16Б), а точнее, с ее областью 4, наиболее изученным
примером будет являться беолк cI бактериофага λ. В качестве активатора
этот белок связывается с сайтом, перекрывающимся с –35 элементом
промотора PRM. В отличие от предыдущего класса активаторов позиция
сайта связывания в данном случае определяется достаточно жестко
(поскольку позиция σ70 по отношению к промотору тоже жестко
фиксирована). Принцип действия рассмотренных выше примеров
активаторов основан на стабилизации уже существующих контактов с ДНК
двух поверхностей РНК-П. Это наиболее простой путь, но имеются примеры
и контактов активаторов с другими участками ( и субъединицами) РНК-П.
Тот же БАК контактирует с N-концевым доменом α-субъединицы в тех
случаях, когда сайт связывания перекрывается с областью –35 промотора.
Белок DnaA активирует промотор PR фага λ за счет контактов с β'
субъединицей РНК-П.
42
А Б В
Г
Рисунок 16 – Контакты активатора транскрипции с РНК-полимеразой:
А – активаторы, контактирующие с карбокси-концом α-субъединицы РНКполимеразы (αCTD); Б – активаторы, контактирующие с σ70-субъединицей
РНК-полимеразы; В – активаторы, имеющие два контакта с РНКполимеразой; Г – активаторы, действующие путем изменения конформации
промотора.
43
В тех случаях, когда активатор связывается с областью -35 промотора,
αCTD не может образовать контакт с ДНК в обычном месте и смещается
выше. В некоторых случаях в такой позиции возможно образование
дополнительного контакта αCTD с активатором (рисунок 16В). Примером
активатора, образующего такой двойной контакт, является FNR (активатор
экспрессии фумаратредуктазы и нитратредуктазы). В случае этого белка одна
субъединица его димера контактирует с σ-фактором РНК-полимеразы, а
другая субъединица контактирует со смещенным αCTD. Таким образом,
каждая субъединица FNR контактирует со своей областью РНК-полимеразы.
Такая же ситуация характерна для части тех CAP-зависимых промоторов, у
которых сайт связывания CAP перекрывается с областью -35. Как уже
говорилось выше, в таких случаях одна субъединица CAP контактирует с Nконцевым доменом α-субъединицы РНК-полимеразы, а другая – может
образовывать дополнительный контакт с αCTD.
Примером активатора, действующего путем изменения конформации
промотора (рисунок 16Г), является белок MerR транспозона Tn501. Димер
этого белка связывается с сайтом, расположенным между -10 и -35 областями
промотора. Связывание ионов ртути вызывает конформационное изменение,
заключающееся в раскручивании ДНК-мишени, что приводит к правильному
расположению -10 и -35 областей промотора и соответственно позволяет
связаться РНК-полимеразе. Еще одним примером такого регулятора является
SoxR (регулятор окислительного стесса). К этому же классу относятся
активаторы, связывание которых с ДНК вводит в структуру последней
резкий изгиб. Нет полной ясности с механизмом работы таких активаторов
транскрипции. Здесь возможны два варианта – контакт с «обратной»
стороной РНК-полимеразы и конформационное изменение структуры ДНК.
Наконец, существуют промоторы, зависящие от двух (и более) активаторов.
Такая множественная зависимость обычно привязывает активность
промотора к различным физиологическим сигналам. В таких ситуациях
44
возможны четыре механизма совместного действия двух регуляторов:
связывание с ДНК одного активатора может зависеть от другого (и
наоборот).
Образование комплекса «репрессор-ДНК» приводит к блокированию
синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, то есть функция генарегулятора состоит, в том, чтобы белок-репрессор прекращал деятельность
структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает
способностью строго специфически связываться с определенными
низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или
эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний
теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким
образом, выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез
мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда
индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его
третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность
связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен
взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под
влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет
способность связываться со своим субстратом. Такая регуляция активности
генов получила название индукция синтеза ферментов.
В большинстве случаев регуляция путем индукции характерна для
катаболических путей, где в качестве индукторов выступают обычно
субстраты этих путей.
45
3.2 Индукция синтеза ферментов
3.2.1 Виды индукции
Если при расщеплении субстрата А образуется последовательный ряд
промежуточных продуктов В, С и т.д. и в этом процессе участвуют ферменты
а, b, с и т.д.:
,
то теоретически возможны несколько схем индукции
ферментов: строго последовательная индукция, полностью
координированная индукция и последовательная индукция координировано
регулируемых путей (рисунок 17).
При строго последовательной индукции (рисунок 17А) синтез
отдельных ферментов может происходить последовательно, или поэтапно, и
каждый следующий фермент будет индуцироваться продуктом
предшествующей реакции. Когда синтез всех ферментов данной цепи
реакций индуцируется координированно, то говорят о полностью
координированной индукции (рисунок 17Б). Таким образом субстрат А будет
вызывать одновременное образование всего ряда ферментов от а до е. Когда
же несколько ферментов, катализирующих ряд начальных реакций
(например, а, b, с), индуцируются совместно и индукция синтеза ферментов
следующей серии реакций (d, e) происходит продуктом последней из этих
реакций (D) или каким-либо другим из них (например, С), то говорят о
последовательной индукции координировано регулируемых групп
ферментов (рисунок 17В).
Быстрое реагирование на появление в среде того или иного субстрата
обеспечивается координированным синтезом всех ферментов, необходимых
для их использования.
46
В нулевое время к клеткам, выросшим в условиях, не вызывавших
индукции, добавляли индуцирующий субстрат.
Рисунок 17 – Время появления индуцибельных ферментов при разных
типах индукции: А – строго последовательной индукции; Б – полностью
координированной индукции; В – последовательной индукции
координировано регулируемых групп ферментов
При последовательной же индукции скорость превращения субстрата,
а, следовательно, и скорость роста клеток микроорганизмов увеличиваются
медленно, что связано с тем, что реакции в клетке должно произойти
накопление концентрации продукта до определенного порогового уровня,
что приведет к стимуляции образования второго фермента.
Целесообразным представляется подразделение ферментов
конвергирующих (сходящихся) путей катаболизма при их регуляции синтеза
на группы, которые будут совместно (координированно) регулироваться и
синтез которых будет в свою очередь индуцироваться продуктом
предыдущей группы ферментов. Детальное изучение регуляции синтеза
ферментов сходящихся катаболических путей происходило на примерах
расщепления триптофана, 4-гидроксибензойной кислоты и миндальной
кислоты клетками Alcaligenes eutrophus Acinetobacter calcoaceticus,
Pseudomonas putida, при этом схемы регуляции у разных видов оказались
различными.
47
3.2.2 Lac-оперон E.coli
Один из наиболее изученных примеров индукции синтеза ферментов
– это синтез фермента, необходимого для использования лактозы клетками
Escherichia coli. Лактоза – дисахарид, который, прежде чем вступить на путь
катаболизма гексоз, должен быть расщеплен:
Клетки дикого типа, растущие на среде с глюкозой, содержат лишь
едва заметные следы β-галактозидазы. Если же выращивать их на среде с
лактозой или иным β-галактозидом, то β-галактозидазная активность
увеличивается в 1000 раз (рисунок 18). Этот фермент может составлять
около 3 % всего клеточного белка и обычно образуется только в присутствии
индуцирующего вещества – лактозы.
Изучению механизма регуляции существенно помогло применение не
используемого бактерией индуктора – 2-пропил-β-тиогалактозида.
Добавление этого вещества приводит к «обманной» индукции β-
галактозидазы: фермент образуется, но не может гидролизовать соединение,
индуцировавшее его синтез, и сделать его доступным для дальнейших
превращений.
Оказалось, что при выращивании клеток Е.coli на среде, которая
содержит глюкозу, то эти клетки не в состоянии использовать лактозу. Если
же такие клетки перенести на среду с лактозой как единственным
источником углерода, то в них через определенный промежуток времени
начнется интенсивный синтез фермента β-галактозидазы, ответственного за
каталитическое расщепление лактозы на D-глюкозу и D-галактозу, что
позволит клеткам Е.coli использовать лактозу в качестве единственного
источника углерода. Если затем опять клетки, растущие на среде с лактозой,
48
перенести на среду с глюкозой, то будет наблюдаться прекращение синтеза
β-галактозидазы.
Рисунок 18 – Индукция образования β-галактозидазы после
добавления к питательной среде лактозы
При изучении индукции β-галактозидазы у Е.coli было установлено,
что к росту клеток на среде с лактозой способны не мутанты, у которых
использование лактозы есть следствие мутации, а все клетки обладают
способностью синтезировать β-галактозидазу. Причем происходит не
активация уже имеющихся в клетках фермента в процессе индукции, а его
синтез de novo из соответствующих аминокислот.
Такой индуцированный синтез ферментов у микроорганизмов был
описан в 30-х гг., однако долгое время оставался неясен механизм этого
процесса. Индуцированный синтез ферментов является основой такого
явления как адаптация организмов к изменяющимся условиям среды.
Природа данного явления, механизм и его роль в клетке были выяснены при
расшифровке механизмов регуляции клеточного метаболизма.
Лактозный оперон Е.coli (рисунок 19), состоящий из трех
структурных генов, промотора и оператора, был первой ферментной
49
системой, на которой Ж. Моно и Ф. Жакоб изучали механизм индукции
синтеза ферментов.
P – промотор, O – оперон, z, y, a – структурные гены, T – терминатор,
R – регуляторный ген.
Рисунок 19 – Структурная организация лактозного оперона E.coli
Согласно теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бактерий
участвуют, по крайней мере, три типа генов: структурные гены, генрегулятор и ген-оператор. Структурные гены кодируют три фермента,
необходимые для расщепления лактозы (структурный ген lacZ – βгалактозидазу, структурный ген lacY – галактозидпермеазу, структурный ген
lacA – тиогалактозидтрансацетилазу). Из них первые два кодируют ферменты
утилизации лактозы: пермеазу и β-галактозидазу.
Также пермеаза необходима для проникновения лактозы из внешней среды в
клетку. Заметим, что даже при «выключенном» lac-опероне имеется
небольшое количество пермеазы. Поэтому при появлении во внешней среде
лактозы какое-то количество ее может проникать внутрь и оказывать
сигнальное воздействие на лактозный оперон. Второй фермент – βгалактозидаза – катализирует распад лактозы на глюкозу и галактозу.
Последние далее вступают в катаболические превращения, обеспечиваемые
50
конститутивными ферментами. При «выключенном» опероне имеется
небольшая активность и этого фермента. Это важно потому, что параллельно
с основной реакцией (гидролизом лактозы) происходит и побочная –
изомеризация лактозы в аллолактозу (где галактоза и глюкоза соединены не
1,4-, а 1,6-гликозидной связью). И именно аллолактоза, а не лактоза, служит
регулятором активности оперона.
В отсутствие лактозы молекула репрессора, активная в свободном
состоянии, связывается с оператором и подавляет транскрипцию
структурных генов (рисунок 20А).
Когда в клетку попадает лактоза (рисунок 20Б), из нее при участии β-
галактозидазы образуется образуется некоторое количество аллолактозы,
содержание которой в неиндуцированных клетках очень невелико,
аллолактоза связывается с белком-репрессором, конформация которого при
этом меняется так, что разрывается связь его с операторным участком, то
есть в результате образуется неактивный комплекс репрессора с индуктором,
который не может взаимодействовать с оператором и, следовательно,
препятствовать транскрипции структурных генов. В результате индуцируется
синтез ферментов катаболизма лактозы.
При удалении из клетки индуктора репрессор снова переходит в
активное свободное состояние, связывается с оператором, что приводит к
прекращению синтеза соответствующих ферментов. Таким образом,
биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит от
функционального состояния репрессора. Если репрессор, который
представляет собой белок, построенный из 4 субъединиц с общей
молекулярной массой около 150000 Да, находится в активном состоянии, не
связан с индуктором, то он блокирует ген-оператор и синтез мРНК не
происходит. При поступлении метаболита-индуктора в клетку его молекулы
связывают репрессор, превращая его в неактивную форму (или, возможно,
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]