Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Принципы надлежащей лабораторной практики (Principles of Good Laboratory Practice, GLP). Учебное пособие
.pdf
51
4.1.2. Практические действия при исследовании испытуемых
объектов
Рассматриваются практические действия сотрудников ИЦ при исследовании испытуемых объектов (лекарственных препаратов).
4.1.2.1. Подготовка определенной дозы испытуемого объек-
та/лекарственного препарата
Как уже говорилось, исследование должно проводиться в соответствии с планом исследования. Образцы, используемые в исследовании,
должны быть идентифицированы для подтверждения их происхождения
(ГОСТ Р 53434, п. 4.8.3). Проведение экспериментов на лабораторных животных должно соответствовать общемировым принципам гуманного обращения с животными. Если в тест-систему вводят неправильную дозу или
если существует сомнение относительно вводимой дозы, можно почти определенно сказать, что эксперимент находится под угрозой. Чтобы этого
избежать, необходимо надлежащим образом следовать установленным
процедурам и документации на каждом этапе процесса.
4.1.2.1.1. Первоначальная подготовка и планирование
Перед началом исследования необходимо рассмотреть ряд факторов и
обсудить их с персоналом и руководителем исследования. Некоторые из
них могут быть рассмотрены до подписания протокола/плана исследования:
информация об уровне дозы, числе животных и объеме дозирования в
плане/протоколе исследования позволяет руководителю исследования рассчитать потребность в испытуемом объекте и обеспечить его достаточное
количество на протяжении всего исследования. При рассмотрении этих
факторов необходимо также проверить чистоту испытуемого объекта. В
большинстве исследований предполагается, что испытуемый объект практически на 100 % представляет собой активное вещество, но если активного вещества содержится значительно меньше, чем это необходимо, следует
скорректировать его общее количество путем взвешивания и исследовать
влияние примесей на достоверность результатов исследования;
требуется рассмотреть концентрацию испытуемого объекта, количество или объем. Объем необходимо варьировать в ходе исследования в зависимости от массы животных, и руководитель исследования должен держать это под контролем. Эти действия следует осуществлять регулярно,
для чего руководитель исследования должен контролировать эти данные
каждые две недели, используя заявку определенной формы;
для каждой процедуры подготовки испытуемого объекта должны существовать СОП, необходимые требования, предъявляемые к анализу, документации и данным, а также эксплуатации всего оборудования;
методы подготовки испытуемого объекта должны быть проверены до
начала исследования. Это означает предварительное проведение испытания с использованием по крайней мере самой высокой дозы, чтобы под-
52
твердить приемлемость различных СОП для исследования испытуемого
объекта;
в ходе данного испытания может быть обнаружена необходимость
дальнейшего развития метода, например, проведения экспериментов с различными растворителями или техниками смешивания;
также необходимо оценить стабильность испытуемого объекта в ис-
пользуемом растворителе. В последующем на основании данного испытания может понадобиться внесение поправок/изменений в соответствующие
СОП.
4.1.2.1.2. Приготовление испытуемого объекта
В большинстве ИЦ приготовлением испытуемого объекта занимается
независимая группа. Это подчеркивает важность четкой регистрации действий, которые были запланированы и осуществлены на самом деле. Даже
если весь процесс выполняет руководитель исследования, план приготовления является важной частью заключительных записей.
Перед тем как открыть контейнер с материалом, сотрудники должны
выполнить процедуры, которые гарантируют, что:
для данной процедуры имеется выделенное рабочее место соответст-
вующего размера;
поверхность для процедур приготовления чистая. Для достижения
этого рабочую поверхность часто покрывают чистым листом бумаги или
пластика, который удаляется после каждой процедуры по приготовлению
испытуемого объекта;
необходимые чистые емкости, шпатели и другое мелкое оборудование
находятся в непосредственной близости (что называется, «под рукой»);
этикетки были подготовлены заранее и доступны для использования;
в это же самое время не обрабатываются никакие другие соединения,
что сводит к минимуму возможность возникновения путаницы или перекрестного загрязнения.
Испытуемые объекты получают из зоны хранения. Идентичность про-
веряют в соответствии с инструкциями, указанными в плане/протоколе и
заказе. Согласно этим инструкциям взвешивают необходимое количество
испытуемого объекта.
Обычно сначала готовят контрольную смесь – контрольный обра-
зец/стандартный образец. Затем смешивают испытуемый объект с растворителем/разбавителем, точно, без отклонений следуя методике, разработанной в процессе подготовки перед началом исследования.
В большинстве случаев этот процесс включает в себя приготовление
определенной концентрации испытуемого объекта следующим путем:
взвешивают каждый испытуемый объект по отдельности, смешивают его
сначала с небольшим количеством растворителя/разбавителя, постепенно
увеличивая количество растворителя до достижения требуемого общего
объема. В некоторых случаях, например, когда разбавителем является пища, рекомендуется сначала приготавливать смесь с высокой концентраци-
53
ей испытуемого объекта, а затем разбавлять образец до достижения более
низкой концентрации.
После приготовления и перед передачей в помещение для животных/виварий испытуемый образец помещают в подходящие контейнеры.
Пригодность контейнеров должна быть тщательно рассмотрена с целью
сохранения целостности испытуемого образца. При этом следует обратить
внимание на следующие элементы:
состав материала контейнера. Контейнер не должен вступать в реакции ни с испытуемым объектом, ни с растворителем/разбавителем;
размер контейнера. Если в процессе приготовления требуется использовать магнитную мешалку для сохранения гомогенности суспензии, контейнер должен быть достаточно большим, чтобы обеспечить вращение
мешалки для получения запланированного объема образца.
Контейнеры, в которые на разных стадиях приготовления помещаются образцы испытуемого объекта, должны быть снабжены этикетками,
чтобы обеспечить их идентификацию. На этикетке контейнера, доставляемого в помещение для животных/виварий, должна излагаться по крайней
мере следующая информация:
номер исследования;
номер группы (если необходимо, пол);
масса контейнера и содержимого;
дата приготовления;
условия хранения.
Во многих лабораториях этикетка имеет цветовую маркировку для
каждого образца испытуемого объекта, совпадающую с цветами этикеток
на клетках с животными.
4.1.2.1.3. Отбор и контроль качества исследуемых препара-
тов/испытуемых объектов
Проведение анализа исследуемых препаратов/испытуемых объектов,
осуществляемое согласно протоколу/плану исследования, должно полностью соответствовать требованиям Принципов GLP и гарантировать, что
оцениваются концентрация, стабильность и гомогенность смеси испытуемого объекта с растворителем/разбавителем. Данная информация может
быть получена после начала исследования.
Чтобы не тратить лишнее время и ресурсы, допускается и даже считается преимуществом проведение некоторых анализов до начала исследования; это позволяет определить, какая форма испытуемого/лекарственного препарата не подходит для данного эксперимента, и
предотвратить неправильное дозирование тест-системы.
Как указывалось выше, необходимо проводить измерение стабильности и гомогенности смеси испытуемого материала и растворителя. Образцы данного препарата получают в условиях, по возможности близких к таковым для препаратов, предназначенным для введения животным. Затем
образцы отбираются в емкости, предназначенные для использования при
введении препарата животным.
54
При проведении длительных исследований приготавливают основной
раствор для дальнейшего получения испытуемого препарата, при этом
также отбирают аликвоты, которые периодически анализируют, чтобы
оценить срок годности препарата и эффективность процесса его приготовления. Однако для подтверждения того, что процесс выполняется корректно на протяжении всего исследования, необходимо проведение периодических проверок, даже если каждый раз приготавливают свежие растворы.
Только химик, который получает пробы испытуемых препаратов для проверки (но не тот сотрудник, который готовит смеси или препараты), знает,
в какой день они были отобраны. Предпочтительно отбирать пробу в помещении для животных/виварии из растворов, которые остались после
введения животным, так как она дает информацию не только о концентрации введенного препарата, но и о гомогенности и стабильности испытуемого образца, используемого в реальности.
4.1.2.1.4. Регистрационные записи о приготовлении препарата
В процессе приготовления препаратов должны быть сделаны сле-
дующие регистрационные записи:
дата;
подтверждение идентичности испытуемого объекта;
идентичность инструкции приготовления (запроса);
масса пустого контейнера;
масса контейнера + масса испытуемого объекта;
окончательная масса смеси;
подпись/инициалы всех сотрудников, выполняющих процедуры.
4.1.3. Режим дозирования
Целью данной процедуры является введение животному требуемого
количества испытуемого материала точно и последовательно. Таким образом, данная процедура должна проводиться тщательно, а записи должны
подтверждать, что всем животным был введен надлежащий объем препарата в соответствующей концентрации. Подробные записи в документе
должны содержать перекрестные ссылки на то, что дозирование было выполнено корректно.
Персонал должен быть хорошо обучен, чтобы квалифицированно вы-
полнять операции по введению препарата животным, учитывая принципы
гуманного обращения с животными. Во многих странах персонал, который
работает с животными, должен иметь лицензию или официальный документ о квалификации, основанный на законах о гуманном обращении с
животными.
По прибытии в помещение для животных/виварий исследуемого пре-
парата должна быть проверена его идентичность и соответствие тому количеству, которое было получено из отдела по приготовлению препарата.
Персонал должен обеспечить, чтобы с контейнером ничего не случилось.
Затем контейнеры размещают в помещении на заранее определенном мес-
55
те до начала введения препарата (например, устанавливают на магнитную
мешалку).
Процедуру введения препарата/дозирования осуществляют в установленном порядке с учетом необходимости сведения к минимуму возможности перекрестного загрязнения и путаницы в отношении экспериментальных животных, групп животных и состава исследуемых препаратов. Для
большинства лабораторий типичными при пероральном введении препаратов животным являются следующие меры предосторожности:
● Введение препарата животным осуществляется последовательно –
группа за группой, с увеличением дозы. Следует обеспечить, чтобы в
конкретный момент времени был открыт только один контейнер с препаратом, а для каждого уровня дозы имеется собственный дозатор или
шприц. Все клетки одной группы животных должны быть идентифицированы до введения исследуемого препарата с использованием нумерации и
этикеток с цветовым кодом в качестве подтверждения.
● Для каждого уровня дозы используют новый дозатор или шприц.
● Контейнер, дозатор и шприц удаляют с места проведения процеду-
ры дозирования перед размещением новой группы животных.
● Внешнюю сторону дозатора протирают чистой тканью перед проце-
дурой введения дозы каждому животному. Это предотвращает возможность попадания испытуемого материала в легкие.
● Каждый раз открывают только одну клетку с животными. Если про-
водят исследование индивидуально размещенных животных, то после дозирования животных возвращают в их клетки. Если проводят исследование
размещенных вместе в одной клетке нескольких животных, животных необходимо помещать во вторую клетку до тех пор, пока всем животным из
клетки не будет введен препарат, а затем возвращать их в клетку.
● Каждое животное должно быть идентифицировано, например, на
основании его метки, а не только по номеру его клетки. Объем дозы рассчитывают из массы тела, используя таблицу перерасчета требуемого объема для каждой массы, чтобы избежать риска возникновения ошибки при
вычислении во время дозирования.
В записях указывают:
персонал, участвующий во введении препарата животному;
дозу исследуемого препарата, введенную каждому животному. Эта
запись служит подтверждением не только самого факта введения исследуемого препарата каждому животному, но и также для проверки дозы в
соответствии с массой тела каждого животного;
дату и время введения исследуемого препарата;
массу каждого контейнера, содержащего исследуемый препарат с
конкретной концентрацией, до и после дозирования. Эта запись позволяет
осуществить проверку ожидаемого использования препарата по сравнению
с фактическим.
56
4.2. ТЕСТ-СИСТЕМА
В Принципах GLP указывается, что тест-системы подразделяются на
физические, химические и биологические тест-системы. Таким образом,
тест-системы могут представлять собой животных, а также растения, бактерии, изолированные органы, клетки/клеточные структуры или даже аналитическое оборудование (ГОСТ Р 53434, п. 4.5).
В данном разделе описывается ситуация, когда тест-системами
являются животные. Условия и процессы должны удовлетворять как на-
учным соображениям в отношении исследования, так и учитывать национальное законодательство по защите животных.
4.2.1. Помещения
В рамках любого исследования руководитель исследования и/или ме-
неджер по уходу за животными должны обеспечить, чтобы персонал, процедуры, оборудование и конструктивные особенности помещения в достаточной мере удовлетворяли потребностям исследования. В частности,
важно приобретать здоровых животных и предотвращать распространение
болезней путем техники разделения, упомянутой в разделе о ресурсах.
4.2.2. Выбор тест-системы
Научный сотрудник должен запланировать определенное количество
животных (не слишком мало и не слишком много), которые по качеству
должны соответствовать требованиям научного исследования. Выбор животных для любого исследования осуществляется руководителем исследования и руководством с учетом фенотипа/генотипа, количества, пола, возраста, поставщика и т.п., а также следующих элементов:
целесообразности модели;
цели исследования и проекта;
наличия исторических данных и прошлого опыта.
Обоснование выбора тест-системы должно быть отражено в пла-
не/протоколе.
4.2.3. Поставщики, размещение заказа, транспорт и доставка
Учитывая общую стоимость неклинических (доклинических) испыта-
ний в настоящее время, можно считать, что на приобретение тест-систем
затрачивается их незначительная часть. Поэтому, заказывая тест-системы,
следует требовать, чтобы они были наилучшего качества. Никакие усилия,
предпринятые испытательным центром, контроль окружающей среды и
оборудования не смогут компенсировать влияния на исследование животных плохого качества. Насколько поставщик животных, кормов и подстилок для животных следует нормам по обеспечению качества, это должно
рассматриваться в процессе аудита. Обычно за это несут ответственность
сотрудники отдела по обеспечению качества и лицо, ответственное за
безопасность животных. Если поставщик является монополистом, профес-
57
сиональное сообщество по обеспечению качества должно более эффективно выражать свое мнение по вопросу качества животных. Покупатели
должны быть уверены в том, что они получают то, за что они заплатили, и
что никакие отклонения от качества невозможны (например, загрязнение
пестицидами, болезни, проблемы с транспортом и т.п.).
ИЦ должен стараться иметь дело с поставщиками, являющимися
партнерами в области научных исследований. Поставщики должны быть
экспертами в своей области. Как правило, они должны принимать во внимание конструктивные замечания и в свою очередь могут предоставлять
полезную информацию и вносить ценные предложения по улучшению качества исследования. Документально оформленный диалог относительно
тест-системы необходимо вести с основными поставщиками. Поставщики
должны предоставлять сертификаты о здоровье животных, отсутствии паразитов и т.п.
Официальные формы для заказа животных (бланки), транспортные
и ветеринарные сертификаты, счета-фактуры являются частью первичных
данных. Следуя СОП, по прибытии в ИЦ необходимо пересчитать животных, определить пол, оценить общее состояние здоровья и стрессовое состояние, вызванное транспортировкой. Оформленную документацию,
в том числе подтверждающую, что животные соответствуют спецификации по возрасту и массе, как определено в протоколе/плане исследования,
вносят в файл данных. Затем животных транспортируют в помещение для
исследования и помещают в чистые клетки с едой и водой в соответствии с
основными СОП.
4.2.4. Акклиматизация/карантин
Одним из требований, указанных в большинстве СОП и протоколах/планах исследования, является необходимость акклиматизации животных. В этот период проверяют состояние здоровья животных. При возникновении заболевания или смертности данную партию животных не используют в исследовании и, при необходимости, безболезненно подвергают эвтаназии (ГОСТ Р 53434, п. 4.5.2.2).
На момент начала исследования все тест-системы должны быть полностью здоровы. Тест-системы, у которых в ходе исследования выявлены
заболевания или травмы, следует изолировать и лечить, если это необходимо для обеспечения полноты исследования. Диагнозы и лечение любых
заболеваний как в ходе исследования, так и до его начала должны быть задокументированы (ГОСТ Р 53434, п. 4.5.2.2).
Продолжительность периода акклиматизации зависит от видов животных, поставщиков и типов исследования (ГОСТ Р 53434, п. 4.5.2.4). Документация о подготовке помещений, доставке животных, обслуживании,
наблюдении, измерениях, условиях окружающей среды и других видах
деятельности в данный период времени должна быть сохранена.
58
4.2.5. Идентификация животных
Идентификация животных не должна претерпевать каких-либо изме-
нений в ходе исследования. Большинство лабораторий использует систему
«кэйдж-карт» («cage-cards») – карточек или этикеток, устанавливаемых на
клетках с животными, в которые вносят определенные данные: временные
перед оценкой группы и постоянные после ее оценки; оформляемые в соответствии с протоколом/планом исследования. Отдел по работе с животными использует последовательные временные номера для учета животных. Постоянную карточку, а также испытуемый материал, часто маркируют определенным цветом (кодом) согласно внутреннему стандарту ИЦ.
Нумерация в рамках исследования является уникальной и охватывает
все данные и образцы, относящиеся к животным, на всех этапах исследования. При выборе группы животных для исследования должны быть
идентифицированы отдельные животные, чтобы не произошла путаница.
Впоследствии в каждом случае, когда животное удаляется из своей клетки,
согласно СОП требуется провести идентификацию животного. Во многих
лабораториях идентификацию осуществляют путем татуировки и даже наносят специальные печати на влажные ткани в конце исследования (после
гистологической обработки) и архивируют.
4.2.6. Назначение групп животных
В соответствии с планом/протоколом исследования животные должны
быть отнесены к определенным группам до процедуры введения испытуемого препарата. Если животные рандомизированы, копии статистической
таблицы или таблицы рандомизации, содержащей временные и постоянные номера животных, включают в исходные данные. С этого момента документируют расположение стоек и клеток. Особое внимание следует уделять документации по учету исключенных из исследования животных в
период акклиматизации. В этих данных могут быть указаны систематические проблемы, относящиеся к поставщику или типу животного. Настораживающие или неожиданные результаты наблюдений должны быть доведены до внимания поставщика. Эти выводы должны быть исследованы, а
их воздействие оценено.
4.2.7. Обслуживание, уход
Обычные (например, уборка/перестановка в помещении, стойке или
клетке) или специальные (например, ограничение в еде и воде) процедуры
по уходу за животными выполняют в соответствии с СОП и ежедневно документируют в журнале или соответствующей системе. Сделанные в этот
период времени наблюдения (например, пустая кормушка, кровь на подстилке и т.п.) должны быть документированы, а руководитель исследования должен их обязательно подписать.
59
4.2.8. Контроль изменений окружающей среды
Основой заботы о надлежащем уходе за животными является требование о том, чтобы в отчет об исследовании было включено «описание
всех обстоятельств, которые могут повлиять на качество и целостность
данных». Осведомленность об этих обстоятельствах во многом зависит от
знания физиологических и поведенческих потребностей животных, программы, определенной в СОП и, конечно, подготовки лаборантов, сотрудников отдела по обеспечению качества и научного персонала. Существует
множество факторов, которые могут помешать проведению исследования,
но в рамках нашего курса мы сможем рассмотреть только основные из них.
После того как СОП разработали, ввели определения и утвердили для
каждой ситуации (продолжительность и тип исследования, виды животных), данные регулярно собирают и оценивают профессиональные сотрудники. Отклонения от определенных норм или вызывающие опасения и непредвиденные обстоятельства документируют и оценивают с точки зрения
возможности осуществления корректирующих действий, какого-либо возможного воздействия на исследование и рассмотрения последствий в заключительном отчете.
В целом каждое отклонение оценивают относительно следующих
элементов:
4.2.8.1. Источник изменения
Примеры:
Температура и влажность часто связаны с системой вентиляции и
кондиционирования, а также наличием и эффективностью резервного генератора.
Загрязнение подстилок обычно связано с производителем сырья.
Загрязнение остатками мыла или детергента зависит от эффективности работы мойщика клеток.
Качество воздуха может зависеть от близости к лаборатории вытяжки
для удаления загрязняющих веществ.
4.2.8.2. Риски
Примеры:
Процедуры, препятствующие бактериологическому загрязнению, в
большей степени важны для долгосрочных, чем для краткосрочных исследований.
Характеристики подстилок и шумовые характеристики могут быть
критичными для тератологических исследований или исследований влияния на давление крови и сердечно-сосудистую систему – в меньшей степени для других типов исследования.
Поломка таймера источника света может быть более критичной для
альбиноса, чем для других особей.
Качество воды может больше беспокоить в случае использования автоматической системы водоснабжения, чем бутилированной воды.
60
Таким образом, оценка риска в большей степени относится к исследо-
ванию, видам животных или специфичности проекта, например, характеристике кормов: размер частиц может оказывать влияние на качество смешанного питания.
Базальный уровень пищевого витамина А может быть критичным при
испытании ретиноидов, но не других родственных испытуемых молекул.
Кроме того, характеристики подстилок могут оказывать влияние на
исследования многими разными способами в зависимости от физических
или химических характеристик.
4.2.8.3. Мониторинг
Примеры:
Необходимо осуществлять мониторинг анализов чистоты клеток, сер-
тификатов анализа кормов, воды и подстилок, записей самописцев, относящихся к оценке состояния окружающей среды, манометров, измерения
скорости воздухооборота, феромонных ловушек и т.п.
4.2.8.4. Контроль
Примеры:
Необходимо осуществлять контроль таймеров источника света, про-
цедур организации барьеров/препятствий, водяных и воздушных фильтров
и т.п.
Систематическое или случайное детектирование нештатных ситуаций
записывается в данные, при этом рассматривается их влияние на результаты. Согласно этому подходу, систематический мониторинг и контроль
должны препятствовать возникновению слишком большого влияния на
тест-систему незафиксированных случаев.
Историческая база данных должна быть составлена с использованием
обычных контрольных значений для конкретных видов (возраст/масса, кривая смертности, гематология и биохимия, выбранные гистопатологические
данные, тератология, типы спонтанных опухолей, несчастные случаи и т.п.),
с которыми сравниваются параметры контрольной группы. Существенное
отклонение от нормальных значений требует рассмотрения безопасности
животных, данных контроля состояния окружающей среды и процедур.
Глава 5. ПРОЦЕДУРЫ ДОКУМЕНТИРОВАНИЯ
5.1. ПЕРВИЧНЫЕ (НЕОБРАБОТАННЫЕ) ДАННЫЕ
Данный раздел относится к сбору экспериментальных данных.
5.1.1. Выполнение процедур и осуществление наблюдений
До начала исследования руководитель исследования должен обеспе-
чить, чтобы:
было задействовано достаточное число обученных и опытных сотруд-
ников;
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]