Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биохимии. Статическая биохимия. Практикум для СПО
.pdf
61
Таблица 9
Специфичность действия ферментов
(амилаза и сахараза)
Фермент
№ пробы
Амилаза
слюны
(мл)
Крахмал
(мл)
Сахароза
(мл)
Реакция
Троммера
(+, –)
Реакция
с йодом
(+, –)
Амилаза
1 1 1 2 1 1
Сахараза
1 1 1 2 1 1
Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов
на действие ферментов
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетки,
мерный пальчик, слюна в разведении 1 : 5, 1 % раствор крахмала, 1 %
раствор NaCl, 1 % раствор CuSO4, 0,1 % раствор йода в KI.
Вещества, усиливающие действие ферментов, называются ак-
тиваторами. Активаторы стимулируют действие ферментов, но,
в отличие от коферментов, не принимают участия в реакции.
Ингибиторами (парализаторами) называются вещества, снижающие скорость ферментативных реакций. Ингибирование действия
ферментов может происходить в том случае, если с активным центром фермента вместо специфического субстрата соединяется близкий структурный аналог субстрата, т. е. вещество, близкое по строению к субстрату (конкурентное торможение). Ингибиторами могут
быть продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо
биохимического процесса.
62
Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия (NaCl) — специфического активатора амилазы. Сульфат
меди (CuSO4) оказывает тормозящее действие на активность амилазы.
Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода.
Ход работы: в три пронумерованные пробирки приливают по
3 мл слюны. В первую пробирку добавляют 2 капли 1 % раствора
NaCl, во вторую — 2 капли 1 % раствора CuSO4, в третью (контрольную) добавляют 2 капли дистиллированной воды. Затем во все три
пробирки приливают по 5 капель 1 % раствора крахмала. Оставляют
на 2 мин. при комнатной температуре. После чего проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодистом калии
(табли. 10).
Таблица 10
Действие активаторов и ингибиторов на ферменты
№
Субстрат
Фермент
Добавленное
вещество
Окраска
с йодом
Вывод
1.
2.
3.
Контрольные вопросы и задания
1. Результаты запишите в таблицы (6–10). Сделайте выводы
о специфичности ферментов.
2. Расскажите, какие виды специфичности действия ферментов
вам известны.
63
3. Укажите, какие методы используются для определения ак-
тивности ферментов.
4. Подумайте, как влияют температура и реакция среды на ак-
тивность фермента.
5. Расскажите, что такое активаторы и ингибиторы ферментов.
Каков механизм их действия.
6. Напишите формулы аминокислот, входящих в состав актив-
ных центров ферментов.
4.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Лабораторная работа № 1.
Определение активности ферментов
в растительных образцах
Цель работы — освоить методы количественного определения
ферментов в растительном материале.
Опыт 1. Определение активности каталазы
растительных образцов
Оборудование и реактивы: конические колбы на 100 мл, мер-
ные колбы на 100 мл, пипетки, бюретка, фарфоровая ступка, воронка,
фильтр «Белая лента», CaCO3 (сух.), 10 % раствор H2SO4, 0,1 н раствор KMnO4, растительный материал (капуста, тыква, кабачок или
любые другие овощи).
Каталаза (КФ: 1.11.1.6) — оксидоредуктаза, действующая на
H2O2 в качестве акцептора. Она является сложным ферментом, состо-
ящим из белкового комплекса и простетической группы, содержащей
64
железо. Каталаза расщепляет перекись водорода на молекулярный
кислород и воду:
ОНООН
каталаза
2222
2 +⎯⎯⎯ →⎯
.
Предлагаемый метод определения активности каталазы основан
на учете количества разложившейся перекиси под действием ферментного препарата методом титрования перманганатом.
Ход работы: навеску 5 г свежего растительного материала рас-
тирают в ступке со стеклянным песком и 0,3 г CaCO3, затем добавляют 20 мл воды и снова тщательно растирают до получения однородной массы. После этого растертую массу водой количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем болтушки до метки.
Через 30–40 мин. смесь фильтруют или центрифугируют. Две порции
чистого фильтрата или центрифугата (по 20 мл) помещают в колбы
на 100 мл. Одну из колб кипятят 2–3 мин. для инактивации фермента
и затем охлаждают. В обе колбы приливают по 20 мл воды и по 3 мл
1 % раствора перекиси водорода. Время инкубации — от 20 до 30
мин. По окончании инкубации к содержимому обеих колб добавляют
4–5 мл 10 % раствора H2SO4 и титруют 0,1 н раствором KmnO4 до
слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение минуты. По разности между контрольным и опытным титрованием определяют количество разложившейся перекиси водорода за время инкубации в расчете на 1 г исходного растительного вещества.
Н
Тва
х
7,1)( −
=
, (1)
где х — активность в миллиграммах H2O2, разложившейся за время
инкубации на 1 г растительного вещества;
65
а — миллилитров 0,1 н раствора KMnO4, израсходованного на
холостое титрование;
в — миллилитров 0,1 н раствора KMnO4, пошедшего на опытное
титрование;
Т — поправка к титру 0,1 н KMnO4;
1,7 — количество миллиграммов H2O2, соответствующее каж-
дому миллилитру 0,1 н KMnO4;
Н — навеска растительного материала.
Опыт 2. Определение активности аскорбатоксидазы
Оборудование и реактивы: термостат, фарфоровая ступка, мерные колбы на 25 и 50 мл, конические колбы на 100 мл, 0,01 н KJO3,
10 % раствор KI, 0,001 н Na2S2O3, 1 % раствор крахмала, фосфатный
буфер 0,15 М с рН 7,0, аскорбиновая кислота (раствор с содержанием
1мг в 1 мл), растительный материал (капуста, тыква, кабачок или любые другие овощи).
Аскорбатоксидаза (КФ: 1.10.3.3) — фермент, относящийся
к классу оксидоредуктаз; она катализирует окисление аскорбиновой
кислоты (витамина С) в дегидроаскорбиновую кислоту. В состав аскорбатоксидазы входит медь. Этот фермент содержится
в значительных количествах в тыкве, кабачках, салате, фасоли и ряде
других растений.
Активность аскорбатоксидазы определяют йодометрическим
измерением количества аскорбиновой кислоты.
Ход работы: навеску 20 г мякоти тыквы растирают в ступке
с 10–15 мл 0,15 М фосфатного буфера с рН около 7 и растертую массу переносят в широкогорлую мерную колбу на 50 мл с доведением
объема взвеси до метки фосфатным буфером. Через 1 ч. настаивания
66
содержимое колбы фильтруют и фильтрат используют в качестве
препарата фермента.
Далее две порции фильтрата по 10 мл помещают в колбы на
50 мл, одну из них нагревают до кипения и кипятят 1–2 мин. для
инактивации фермента, а затем охлаждают. Колбы ставят в термостат
при температуре 37 °С и после добавления 10 мл раствора аскорбиновой кислоты инкубируют смесь в течение 30 мин. Затем содержимое
обеих колб нагревают до кипения и после охлаждения доводят до
метки.
По 10 мл прозрачной жидкости переносят в конические колбы
емкостью 100 мл и добавляют по 5 мл 10 % раствора KI, 10 мл 5 %
раствора HCI, 10 капель 1 % раствора крахмала и по 10 мл 0,01 н раствора KIO3 в каждую из колб.
Через пять минут после прибавления последнего реактива растворы титруют 0,001 н раствора Na2S2O3 до исчезновения синей
окраски.
Результаты определения проводят по следующей форме:
Н
Тва
х
088,0)( −
=
, (2)
где х — активность аскорбатоксидазы, выраженная в миллилитрах
окисленной аскорбиновой кислоты под действием фермента из 1 г
растительного материала за период инкубации;
а — миллилитров 0,001 н раствора гипосульфита, израсходованного на оттитровывание избытка йода в опытном определении;
в — миллилитров 0,001 н раствора гипосульфита, израсходованного на титрование контрольной пробы;
Т — поправка к титру 0,001 н Na2S2O3;
67
0,088 — количество миллиграммов аскорбиновой кислоты, со-
ответствующее каждому миллилитру 0,001 н Na2S2O3;
Н — навеска вещества, соответствующая объему препарата, взятого для титрования (в г).
Контрольные вопросы и задания
1. Рассчитайте содержание ферментов в растительных образ-
цах, сформулируйте выводы.
2. Расскажите, какими свойствами обладают ферменты.
3. Перечислите, чем отличаются ферменты от неорганических
катализаторов.
4. Установите, при каких условиях ферменты действуют более
активно. Почему?
5. Напишите уравнения реакций (с использованием структурных
формул субстратов) и определите класс ферментов, которые участвуют в следующих превращениях:
1) аденозин + Н2О → аденин + рибоза;
2) АМФ + Н2О → аденозин + Н3РО4;
3) аденозин + H3PO4 → аденин + β-D-рибофуранозо-1–фосфат;
4) глутаминовая кислота +NH3 + АТФ → глютамин + АДФ +
Н3РО4;
5) фумаровая кислота + NH3 → аспарагиновая кислота;
6) аденозин + Н2О → инозит +NH3;
7) глутаминовая кислота → γ-аминомасляная кислота;
8) NH3 + СО2 + АТФ → АДФ + карбамоилфосфат;
9) ПВК → СО2 ацетальдегид;
10) ПВК + СО, + АТФ → ЩОК + АДФ + Н3РО4;
11) ацетил-КоА + глиоксиловая кислота → малатоил-КоА;
68
12) стеариновая кислота + HS-KoA + АТФ →стеарил-
КоА+АМФ + пирофосфат.
Литература:
1. Биологическая, физическая и коллоидная химия : методиче-
ские указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического ф-та спец. «Зоотехния» /
составители : В. В. Осташкова, В. П. Андреев, Я. П. Нижник ; редактор : Л. П. Соколова. — Петрозаводск : Изд-во ПетрГУ, 2007. — 100 с.
2. Биохимия : электронный учебно-методический комплекс дис-
циплины / Т. Н. Замай, Н. М. Титова, Е. И. Елсукова, А. В. Еремеев. —
Версия 1.0. — Электрон. дан. — Красноярск : ИПК СФУ, 2008. —
1 электрон. опт. диск (DVD) : цв.; 12 см.
3. Болдырева, О. И. Методы исследования пищевых продуктов :
методические указания к лабораторным работам / О. И. Болдырева,
Е. М. Мозгунова. — Оренбург : ОГУ, 2012. — 70 с.
4. Лабораторный практикум по биологической химии для сту-
дентов фармацевтического факультета : учебное пособие / И. А. Позднякова [и др.] ; под редакцией В. Ю. Сереброва, Т. С. Федоровой. —
Томск : Сибирский гос. мед. ун-т, 2010. — 253 с.
5. Методическое пособие для практических занятий по биохи-
мии / Е. И. Ерлыкина, П. П. Загоскин, С. П. Калашников, Т. И. Шлапакова, Т. С. Семенова, Л. И. Якобсон, О. И. Александрова. — Нижний
Новгород : Изд-во Нижегородской гос. мед. академии, 2008. — 70 с.
6. Методическое пособие к малому практикуму по биохимии /
составители : С. А. Коннова, А. А. Галицкая, Е. В. Плешакова,
Е. С. Тучина ; под общей редакцией В. В. Игнатова. — 5-е изд., перераб. и доп. — Саратов : Изд-во Саратовского ун-та, 2013. — 73 с.
69
7. Методическое руководство для практикума по биохимии :
учебно-методическое руководство / Н. С. Сиянова, Т. А. Невзорова,
С. Н. Неуструева. — Казань : КГУ, 2008. — 46 с.
8. Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии : учебник для студен-
тов вузов, обучающихся по направлению и специальности «Химия» и
«Биология» / Ю. Б. Филиппович. — 4-е изд., перераб. и доп. —
Москва : Агар ; Санкт-Петербург : Флинта, 1999. — 507 с.
70
5. ВИТАМИНЫ
Витамины — биорегуляторы биохимических и физиологических процессов, протекающих в живых организмах. Витамины являются низкомолекулярными органическими соединениями различной
химической природы. Для нормальной жизнедеятельности человеку
витамины необходимы в небольших количествах. Нормы суточного
потребления витаминов приведены в табл. 11. Так как витамины не
синтезируются организмом, они должны поступать в необходимом
количестве с пищей в качестве ее обязательного компонента. Отсутствие или недостаток витаминов в организме человека вызывают болезни недостаточности — авитаминозы. При избыточном приеме витаминов, значительно превышающем физиологические нормы, могут
развиваться гипервитаминозы. Это характерно для жирорастворимых
витаминов, доля которых в суточном рационе человека невысока.
В качестве единицы измерения витаминов пользуются размерностью мг % = 0,001 г (миллиграммов витаминов в 100 г продукта),
мкг % = 0,001 мг (микрограммов витаминов в 100 г продукта).
Ряд витаминов представлены не одним, а несколькими соединениями, обладающими сходной биологической активностью, например, пиридоксин (витамин В6) включает пиридоксин, пиридоксаль,
пиридоксамин.
Различают собственно витамины и витаминоподобные вещества.
К витаминоподобным веществам относятся: биофлавоноиды (витамин
Р), пангамовая кислота (витамин В15), парааминобензойная кислота
(витамин Н1), оротовая кислота (витамин В13), холин (витамин В4),
инозит (витамин Н3), метилметионинсульфоний (витамин U), липоевая
кислота, карнитин (витамин В). Витаминоподобные соединения также
участвуют в биохимических процессах организма человека.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]