Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биохимии. Статическая биохимия. Практикум для СПО
.pdf
11
− краткое описание хода работы с указанием условий проведе-
ния опыта;
− рисунки и схемы используемых приборов;
− наблюдения;
− уравнения протекающих реакций;
− расчеты, таблицы, графики;
− выводы.
3. Тетрадь с лабораторными записями нужно вести чисто
и аккуратно, записи должны быть лаконичными.
4. Отчет о проведенной работе проверяет и подписывает препо-
даватель.
5. К сдаче зачета по лабораторному практикуму допускаются
студенты, выполнившие и подписавшие у преподавателя все лабораторные работы.
6. Студенты, получившие зачет по лабораторному практикуму,
допускаются к сдаче итоговой аттестации по курсу биологической
химии.
12
2. БЕЛКИ
Белки — это высокомолекулярные биополимеры, структурную
основу которых составляют полипептидные цепи, построенные из
аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидной
связью.
На долю белков у животных приходится около половины сухой
массы, у растений — 20–35 %. В белках массовая доля углерода в
среднем составляет ~50 %, водорода — ~7 %, кислорода — ~23 %,
азота — ~16 %, серы — ~1–3 %. В их составе также встречаются
и другие химические элементы.
При гидролизе белковой молекулы образуются аминокислоты. В
составе белков встречаются 20 стандартных аминокислот (табл. 1).
Таблица 1
Аминокислоты, входящие в состав белков, и их строение
Название
Строение
Полное
Сокращенное
Заменимые
Глицин
Гли
Аланин
Ала
Цистеин
Цис
Глутаминовая кислота
Глу
13
Название
Строение
Полное
Сокращенное
Аспарагиновая кислота
Асп
Тирозин
Тир
Пролин
Про
Серин
Сер
Аспарагин
Асн
Глутамин
Глн
Незаменимые
Валин
Вал
Лейцин
Лей
Изолейцин
Изолей
14
Название
Строение
Полное
Сокращенное
Треонин
Тре
Метионин
Мет
Фенилаланин
Фенала
Триптофан
Трип
Лизин
Лиз
Гистидин*
Гис
Аргинин*
Арг
Примечание: * условно заменимые
15
Для каждой стандартной аминокислоты существует генетиче-
ский код, при помощи которого в генах записана информация о кодируемом белке. Кроме 20 стандартных аминокислот в составе белка
встречаются и другие аминокислоты, они образуются в результате
модификации стандартных аминокислот после того, как последние
были включены в состав молекулы белка.
Между аминокислотными остатками в молекуле белка суще-
ствуют различные химические взаимодействия: это ковалентные,
ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ван-дерваальсовы силы.
Отмеченные выше химические связи и взаимодействия прини-
мают участие в формировании структуры белковых молекул. Благодаря пептидным связям образуются полипептидные цепи, и таким
образом формируется первичная структура белка. Пространственная
организация белковой молекулы определяется в основном водородными, ионными связями, ван-дер-ваальсовыми силами, гидрофобными взаимодействиями. Водородные связи, возникающие между пептидными группами, определяют вторичную структуру белка. Формирование третичной и четвертичной структур осуществляется
водородными связями, образующимися между радикалами полярных
аминокислот, ионными связями, ван-дер-ваальсовыми силами, гидрофобными взаимодействиями. Дисульфидные связи принимают участие в стабилизации третичной структуры. Структура белковой молекулы очень лабильна и легко разрушается под влиянием различных
физических и химических воздействий, в результате чего изменяются
ее биологические и физико-химические свойства.
Белки выполняют разнообразные функции. В связи с этим среди
них различают структурные, питательные, запасные, сократительные,
транспортные, каталитические, защитные, рецепторные, регуляторные и другие белки.
16
2.1. СТРОЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
АМИНОКИСЛОТ
Лабораторная работа № 1.
Приготовление рабочих растворов белков
для проведения качественных реакций
Цель работы — освоить методы приготовления рабочих рас-
творов белков.
В качестве объектов исследования при проведении качествен-
ных реакций на открытие функциональных групп (цветных реакций)
в молекуле белка могут быть использованы различные вещества,
например: белок куриного яйца, белок мяса и растительный белок,
желатин и др.
Оборудование и реактивы: химический стакан, стеклянная па-
лочка, воронка, фильтр «Белая лента» или стерильная марля, центрифуга, 10 % раствор NaCl, раствор (NH4)2SO4, CH3COOH (ледяная),
куриное яйцо, пшеничная мука, желатин, молоко.
Ход работы:
Опыт 1. Приготовление белка куриного яйца (неразбавлен-
ного). Отделяют белок трех куриных яиц от желтков. Считая, что
среднее количество белка в одном яйце равно 33 г (а желтка — 19 г),
в среднем получают около 100 мл неразбавленного раствора белков
куриного яйца. Этот раствор содержит 88 % воды, 1 % углеводов и
0,5 % минеральных веществ, оставшаяся часть приходится на белок.
Таким образом, полученный неразбавленный белок куриного яйца
представляет собой примерно 10 % раствор белка.
17
Опыт 2. Приготовление разбавленного раствора белка. Бе-
лок одного куриного яйца после отделения от желтков разбавляют в
10 раз дистиллированной водой и хорошо встряхивают. Далее полученный раствор фильтруют либо через смоченный двойной слой марли, либо через фильтр «Белая лента», в осадке остается яичный глобулин. Учитывая, что концентрация альбумина в неразбавленном
белке куриного яйца составляет около 6 %, полученный разбавленный раствор яичного альбумина имеет концентрацию 0,5 %.
Опыт 3. Приготовление белков мяса. В стакан помещают 40–
50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного мяса, добавляют
80–100 мл 10 % раствора поваренной соли и оставляют на 15–20 мин.,
при этом часто перемешивают. Полученный раствор отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр. В данном растворе главным
образом содержатся мышечный альбумин и глобулин.
Опыт 4. Приготовление белков молока. К 50 мл свежего моло-
ка добавляют равный объем насыщенного раствора (NH4)2SO4.
В результате осаждения в осадок выпадают глобулины и казеин. Далее
раствор отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр («Белая лента») и получают на выходе прозрачный раствор альбуминов.
Опыт 5. Приготовление растительного альбумина. Пшеничную муку (25 г) смешивают со 100 мл дистиллированной воды и полученную смесь встряхивают в течение часа во встряхивателе. Полученную взвесь муки центрифугируют, а затем центрифугат фильтруют через складчатый фильтр. Данный раствор содержит
преимущественно альбумин пшеничных зерен.
Опыт 6. Приготовление раствора желатина. 1 г желатина растворяют в 1 л горячей дистиллированной воды, затем прибавляют
5 мл ледяной уксусной кислоты. Тщательно перемешивают.
18
Контрольные вопросы и задания
1. Расскажите, что представляет собой белковая молекула.
2. Подумайте, какие вещества можно использовать для приго-
товления рабочих растворов для цветных реакций.
3. Укажите, какова специфика их приготовления.
Лабораторная работа № 2.
Методы качественного обнаружения белков
(цветные реакции)
Цель работы — ознакомиться с основными наиболее распространенными цветными реакциями на белки и доказать, что с их помощью можно выявить сходства и различия в аминокислотном составе
исследуемых белков (например, яичного альбумина, желатина и др.).
Аминокислоты, входящие в состав белков, различаются друг от
друга природой радикала. Это разнообразие дает возможность обнаружения большинства аминокислот с помощью цветных реакций.
Многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позволяет открывать ничтожные количества той тили иной индивидуальной аминокислоты в составе сложных смесей, биологических
жидкостей, гидролизатов белков и т. п. Некоторые цветные реакции
находят применение для количественного определения аминокислот.
Методы качественного обнаружения белков основаны на двух
типах реакций:
а) по пептидным связям белковой молекулы;
б) по ее аминокислотным радикалам.
Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция.
Примерами реакций второго типа являются многочисленные цветные
реакции на радикалы аминокислот. По характеру цветных реакций
второго типа можно судить до некоторой степени о составе белков.
19
Опыт 1. Обнаружение в молекуле белка пептидных связей
(биуретовая реакция, или реакция Пиотровского)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, разбавленный раствор белка, раствор желатина,
30 % раствор NaOH, 5–7 % растворы CuSO4.
Реакция основана на способности пептидной группы белков
и полипептидов образовывать в щелочной среде с ионами Сu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком, в зависимости от количества пептидных связей.
Биуретовая реакция положительна с белками и пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. Биуретовую реакцию дают
аспарагин, гистидин, а также небелковые вещества, содержащие не
менее двух пептидных групп, например производное мочевины —
биурет, давший название этой реакции:
Пептидная группа в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:
При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд и медь, взаимодействуя с кислородом,
образует ковалентную связь, а взаимодействуя с атомами азота, —
координационные связи. Схематично реакцию можно представить в
виде уравнения:
20
Ход работы: в пробирку вносят 1–2 мл раствора белка, прибавляют двойной объем 30 % раствора гидроксида натрия, хорошо перемешивают и добавляют 2–3 капли 5–7 % раствора CuSO4. Тщательно
перемешивают. Развивается фиолетовое окрашивание. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1 % раствора сульфата меди. При
стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.
Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция
на ароматическое кольцо циклических аминокислот
(реакция Мульдера)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, спиртовка, держатель для пробирок, разбавленный
раствор белка, раствор желатина, НNO3 (конц.), 30 % раствор NaOH.
Реакция основана на способности присутствующих в молекуле
белка ароматических аминокислот (тирозина, фенилаланина и триптофана) образовывать с концентрированной азотной кислотой при
нагревании динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание. Например, в реакции с тирозином образуется
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]