Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биохимии. Статическая биохимия. Практикум для СПО
.pdf
41
Таблица 4
Приготовление буферных систем
для определения ИЭТ желатина
№
пробирки
Н
2
О
0,1 М раствор
СН
3
СООН
1 М раствор
СН
3
СООН
0,1 М раствор
СН
3
СООNa
1 % раствор
желатина
рН
среды
1
2
3
4
5
6
Контрольные вопросы и задания
1. Охарактеризуйте возможные экспериментальные варианты
определения изоэлектрической точки белка.
2. Объясните, почему белки при нагревании в изоэлектрической
точке быстро выпадают в осадок и не выпадают при нагревании в
сильнокислой или сильнощелочной среде.
3. На основании полученных данных сделайте вывод о значе-
нии изоэлектрической точки и об особенностях аминокислотного состава данного белка.
42
2.3. СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ
Лабораторная работа № 1.
Выделение и анализ химического состава
сложных белков
Цель работы — изучить строение и свойства сложных белков
посредством качественного и количественного анализа.
Сложные белки — это белки, содержащие в своей структуре
компоненты небелковой природы, так называемые простетические
(добавочные) группы. В зависимости от химической природы этого
компонента сложные белки делятся на нуклео-, хромо-, глико-, липо-,
фосфо- и металлопротеиды.
Опыт 1. Гликопротеиды. Выделение муцина из слюны
Оборудование и реактивы: пипетка, стакан лабораторный, во-
ронка, фильтр «Белая лента», стеклянная палочка, пробирки, химический стакан на 100 и 200 мл, пробирка биологическая на 50 мл, воронка, фильтры, стеклянная палочка, мерный цилиндр, CH3COOH
(конц.), 30 % раствор NaOH, 1 % раствор CuSО4, α-нафтол, H2SO4
(конц.).
Гликопротеиды содержат в своей молекуле, помимо простого
белка, углеводный компонент. Гликопротеиды присутствуют почти
во всех тканях и жидкостях организма, в секретах слизистых желез
(муцины), входят в состав костной, хрящевой и соединительной тканей (мукоиды). В организме они играют важную роль, выполняя
опорную, защитную функции, препятствуют проникновению инфекций в организм, участвуют в процессах межклеточного взаимодействия («узнавания»).
43
Ход работы:
1. Выделение муцина из слюны: в пробирку собирают 1–2 мл
слюны и по каплям приливают концентрированную уксусную кислоту (2–3 капли). Выпадает осадок муцина. Через 3 мин. жидкость
фильтруют, сгусток на фильтре промывают водой из пипетки (10–
20 капель), осторожно переносят в пробирку и добавляют 30 % раствор NaOH до полного растворения осадка (около 20 капель). С содержимым пробирки (щелочным раствором муцина) проводят следующие реакции.
2. Проведение качественных реакций:
− реакция на белковый компонент: к 10 каплям щелочного рас-
твора муцина прибавляют 1–2 капли 1 % раствора CuSО4. Положительная проба биуретовой реакции доказывает присутствие в пробе
белка;
− реакция на углевод: к 10 каплям раствора муцина добавляют
2 капли раствора α-нафтола, хорошо перемешивают. Раствор нейтрализуют, осторожно добавляя 3 капли H2SO4 (конц.). На границе раздела жидкостей появляется окрашенное кольцо фиолетового цвета.
Опыт 2. Гликопротеиды. Открытие
углеводного компонента в яичном белке
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки, стеклянная палочка, раствор белка, H2SO4 (конц.), 1 % раствор тимола, CH3COOH
(конц.).
При взаимодействии H2SO4 (конц.) с гексозами или пентозами
происходит их дегидратация: из пентоз образуется фурфурол, а из
гексоз — оксиметилфурфурол. Они дают с тимолом или α-нафтолом
в присутствии концентрированной серной кислоты продукты конденсации красного цвета.
44
Ход работы: к 10 каплям профильтрованного гидролизата (см.:
Приготовление рабочих растворов белков для проведения качественных реакций) добавляют 2–3 капли 1 % раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осторожно наслаивают 20 капель H2SO4
(конц.). При встряхивании на дне пробирки образуется красное окрашивание вследствие образования продукта конденсации фурфурола с
тимолом.
Опыт 3. Фосфопротеиды.
Выделение казеина из молока
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетка, стакан лабора-
торный, воронка, фильтр «Белая лента», стеклянная палочка, пробирки, водяная баня, молоко, CH3COOH (конц.), 30 % раствор NаOH, реактивы для проведения качественных реакций на белки (биуретовой и
ксантопротеиновой), раствор фенолфталеина, HNO3 (конц.), молибденовый реактив.
Фосфопротеиды содержат в качестве простетической группы
фосфорную кислоту. Они служат важнейшим питательным материалом для развития эмбриона и растущего организма. Так, казеин молока, вителлин яичного желтка включают незаменимые аминокислоты,
важнейшие минеральные вещества — фосфор и кальций.
Ход работы:
1. Выделение и гидролиз казеина: в пробирку к 1–2 мл молока
добавляют 1–2 капли CH3COOH (конц.). Через 5 мин. надосадочную
жидкость осторожно сливают, а в пробирку с осадком казеина добавляют 2–3 мл дистиллированной воды и через 5 мин. избыток надосадочной жидкости сливают, а осадок фильтруют. Казеин собирают с
фильтра в пробирку и растворяют в 4 мл 30 % раствора NaOH. Содержимое пробирки кипятят 1 мин. на водяной бане, затем охлаждают и проводят реакции для выявления продуктов гидролиза казеина.
45
2. Качественные реакции на составные части:
− обнаружение белка: проводят биуретовую или ксантопротеи-
новую реакции. Наблюдают изменения в окраске осадка;
− обнаружение фосфорной кислоты: к 10 каплям гидролизата
казеина добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям
HNO3 (конц.) до обесцвечивания. Затем добавляют 20 капель молибденового реактива, нагревают до кипячения и охлаждают. Появление
желтого мелкого хлопьевидного осадка свидетельствует о присутствии фосфорной кислоты.
Опыт 4. Нуклеопротеиды. Выделение
рибонуклеопротеида (РНП) из дрожжей
Оборудование и реактивы: пипетка на 2 мл, стакан лаборатор-
ный, воронка, фильтр, стеклянная палочка, пробирки, химические
стаканы на 100 мл и 200 мл, пробирка биологическая (V = 50 мл), воронка, фильтры, стеклянная палочка, обратный воздушный холодильник, центрифуга, мерный цилиндр, ступка с пестиком, лакмусовая бумажка, держатель, спиртовка, пекарские дрожжи, диэтиловый
эфир, речной песок, 0,4 %, 30 % растворы NaOH, 10 % раствор
СН3СООН, 1 н и 2 н растворы HCl, 1 %, 7 % растворы CuSO4, 0,1 %
раствор α-нафтола, H2SO4 (конц.), 1 % раствор дифениламина, NH4
(конц.), 2 н раствор NaOH, 1 % раствор AgNO3, 1 % раствор молибдата аммония в азотной кислоте.
Нуклеопротеиды относятся к группе сложных белков, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты.
Ход работы:
1. Выделение нуклеопротеида из дрожжей: 10 г дрожжей сме-
шать в ступке со смесью 2 мл эфира и 2 мл воды, добавить 5 г речного песка и тщательно растереть, приливая к растертой массе неболь-
46
шими порциями 40–50 мл 0,4 % раствора NaOH. Растирание продолжать 15–20 мин., после этого осадок отфильтровать или отделить
центрифугированием. Центрифугат слить в стакан и прибавить к
нему небольшими количествами (по 0,5 мл) 10 % раствор СН3СООН
до слабокислотной реакции по лакмусу (5–6 мл). Полученный осадок
нуклеопротеида отделить путем центрифугирования.
2. Гидролиз нуклеопротеида: в колбу для гидролиза
(с обратным воздушным холодильником) поместить осадок нуклео-
протеида и равный ему объем 2 н раствора соляной кислоты и сверх
этого еще 20 мл 1 н раствора этой кислоты. Колбу закрыть пробкой с
проходящим через нее воздушным холодильником (трубка длиной 70
см и D = 0,7–0,8 см) и смесь кипятить на водяной бане или плитке с
асбестовой сеткой в течение 1 ч. (с момента закипания), поддерживая
только слабое кипение, во избежание улетучивания HCl. Гидролизат
отфильтровать и в прозрачном растворе определить наличие белка,
пентозы, пуриновых оснований и фосфорной кислоты.
3. Качественные реакции на составные части:
− реакция на белковый компонент: в пробирку вносят 10 ка-
пель полученного раствора гидролизата, прибавляют 10 капель 30 %
раствора NaOH и 2 капли 1 % раствора CuSO4. Все тщательно перемешивают, наблюдают за изменением цвета (появляется розовая или
розово-фиолетовая окраска);
− открытие пентозы (рибозы) возможно несколькими способами.
Первый способ. В пробирку наливают 10 капель гидролизата,
добавляют 1–2 капли 0,1 % раствора α-нафтола и хорошо перемешивают. Затем осторожно по стенке пробирки приливают 10–15 капель H2SO4 (конц.). При стоянии на границе раздела двух фаз появляется фиолетовое окрашивание. Реакции проводят только в сухих
пробирках!
47
Второй способ. В пробирку наливают 5 капель гидролизата, добавляют 15–20 капель 1 % раствора дифениламина и кипятят на водяной бане. Через 15–20 мин. кипения в пробирке появляется синефиолетовое окрашивание.
Третий способ (проба Троммера). К 5 каплям гидролизата добавить 10 капель 30 % раствора NaOH и 5 капель 7 % раствора CuSO4
до появления неисчезающей мути Cu(OH)2. Жидкость перемешивают,
верхний слой нагревают до кипения, при этом выпадает осадок оксида меди (II). В данном случае можно сульфат меди заменить на реактив Фелинга;
− проба на пуриновые основания обнаруживаются по их реак-
ции с аммиачным раствором гидроксида серебра. К 2 мл гидролизата
прилить по каплям раствор аммиака (конц.) до щелочной реакции по
лакмусу и добавить равный объем заранее приготовленного аммиачного раствора гидроксида серебра (к 3–4 каплям AgNO3 прибавляют
несколько капель 2 н раствора NaOH, при этом выпадает белый осадок оксида серебра Ag2O. Далее по каплям добавляют 2 н раствор
аммиака, происходит растворение оксида с образованием комплекса
[Ag(NH3)2]OH). Постепенно образуется хлопьевидный светло-коричневый или бурый осадок серебряных солей пуриновых оснований;
− реакция на фосфорную кислоту: к 2 мл раствора молибдата
аммония в азотной кислоте прибавить 1 мл испытуемого раствора.
Смесь слегка нагреть, после резко охладить под струей воды. Образуется желто-зеленый осадок состава (NH4)3PO4·12MoO3.
Контрольные вопросы и задания
1. Результаты работ внесите в табл. 5.
48
Таблица 5
Результаты исследования
Исследуемый
материал
Используемые
реактивы
Открытый
компонент
К какой группе
сложных белков
относится
1. и т. д.
2. Сделайте выводы о проделанной работе, качественные реак-
ции подтвердите уравнениями.
3. Расскажите, что такое нуклеопротеиды и из каких компонен-
тов они состоят.
4. Определите, какие простые белки входят в состав нуклеопро-
теидов и какова особенность их аминокислотного состава.
5. Расскажите, какими качественными реакциями можно от-
крыть продукты гидролиза нуклеиновых кислот.
6. Перечислите, какие продукты образуются при гидролизе уг-
леводной части гликопротеидов.
7. Расскажите, что такое фосфопротеиды и с помощью какой
реакции можно открыть их фосфорную кислоту.
Литература:
1. Биологическая, физическая и коллоидная химия : методические указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического ф-та спец. «Зоотехния» /
составители : В. В. Осташкова, В. П. Андреев, Я. П. Нижник ; редактор : Л. П. Соколова. — Петрозаводск : Изд-во ПетрГУ, 2007. — 100 с.
2. Биохимия : электронный учебно-методический комплекс дисциплины / Т. Н. Замай, Н. М. Титова, Е. И. Елсукова, А. В. Еремеев. —
Версия 1.0. — Электрон. дан. — Красноярск : ИПК СФУ, 2008. —
1 электрон. опт. диск (DVD) : цв.; 12 см.
3. Комов, В. П. Биохимия : учебник для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 655500 «Биотехнология» / В. П. Комов, В. Н. Шведова. — 2-е изд., испр. — Москва :
Дрофа, 2006. — 639 с.
49
3. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекуляр-
ные соединения — полинуклеотиды. Нуклеотиды содержат пуриновое (аденин или гуанин) или пиримидиновое (цитозин, тимин или
урацил) основание, углевод (рибозу или дезоксирибозу) и фосфорную
кислоту.
Различают два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибону-
клеиновые кислоты) и РНК (рибонуклеиновые кислоты). Различие в
углеводных компонентах: в ДНК — дезоксирибоза, в РНК — рибоза,
а также в том, что в ДНК содержится тимин, а в РНК — урацил вместо тимина.
В живых организмах нуклеиновые кислоты входят в состав нук-
леопротеидов.
Нуклеопротеиды — комплексы белка, которые являются со-
ставными элементами ядер живых клеток и вирусов. Связь белка, который обладает основными свойствами, с молекулами нуклеиновой
кислоты (НК) происходит за счет ионных и водородных связей и легко разрушается путем солевой коагуляции. В результате этого НК могут быть выделены в чистом виде. Нуклеотидами называют природные или синтетические соединения, в которых гидроксилы углеводного остатка нуклеозида этерифицированы одной или несколькими
фосфатными группами. Нуклеозиды — природные или синтетические соединения, молекулы которых состоят из пуриновых или пиримидиновых оснований, связанных N-гликозидной связью с остатком D-рибозы или 2-дезокси-D-рибозы. Важную роль в установлении
строения НК играет реакция гидролиза, которая может происходить
согласно приведенной схеме:
50
Нуклеопротеид → нуклеиновая кислота (+ Белок) → Нуклеотид →
Нуклеозид (+ Н3РО4) → Пурины + пиримидины + Пентозы
Молекулы НК всех типов живых организмов — это длинные неразветвленные полимеры нуклеотидов. Роль мостика между нуклеотидами выполняет 3, 5-фосфодиэфирная связь, объединяющая 5-фосфатный остаток одного нуклеотида и 3-гидроксильный остаток углеводной части следующей цепи. Поэтому цепь является полярной. Данный тип связи отражает первичную структуру нуклеиновых кислот.
Нуклеиновые кислоты в клетке находятся в виде нуклеопротеидных комплексов, которые рассматриваются как сложные белки,
простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Лабораторная работа № 1.
Качественные реакции
на компоненты нуклеиновых кислот
Цель работы — изучить строение нуклеиновых кислот.
Для изучения химического состава нуклеиновых кислот проводят кислотный гидролиз дрожжей, богатых нуклеопротеинами (сложными белками, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты), и в полученном гидролизате выявляют компоненты
этих кислот при помощи следующих качественных реакций.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]