Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биохимии. Статическая биохимия. Практикум для СПО
.pdf
21
динитротирозин, добавление гидроксида натрия приводит к образованию натриевой соли хиноидной структуры динитротирозина.
Реакция получила название ксантопротеиновой (от греч.
Xanthos — «желтый»).
Образование желтых пятен на коже при попадании азотной кислоты обусловлено этой реакцией и связано с несоблюдением техники
безопасности с концентрированными растворами.
Ход работы: к 1 мл раствора белка добавляют 5–6 капель концентрированной азотной кислоты (пипеткой) до появления белого
осадка или мути от свернувшегося белка. Далее провести нагревание
в пламени спиртовки. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. После охлаждения в пробирку добавляют по каплям 30 % раствор NaOH до появления оранжевого окрашивания.
Опыт 3. Реакция с пикриновой кислотой
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, держатель для пробирок, спиртовка, разбавленный
раствор белка, раствор желатина, пикриновая кислота, NaCO3 (cух.).
22
Восстановление пикриновой кислоты в пикраминовую осуществляется за счет дикетопиперазиновых группировок, которые могут возникнуть вследствие конденсации аминокислот, высвобождающихся из белковой молекулы при кипячении аминокислот в щелочной среде, а также за счет НS-групп белков. Вместе с тем
восстановление пикриновой кислоты возможно аминосахарами, моносахарами, моносахаридами и другими соединениями, входящими в
состав некоторых белков в качестве нормальных ингредиентов. Поэтому данная реакция малоспецифична.
Ход работы: к 2 мл раствора белка прибавляют 0,5 г карбоната
натрия, далее прибавляют 1 мл насыщенного раствора пикриновой
кислоты, перемешивают и нагревают в пламени горелки несколько
минут. Желтая окраска раствора постепенно переходит в красную
вследствие восстановления пикриновой кислоты в пикраминовую.
Опыт 4. Реакция Паули
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, разбавленный раствор белка, раствор желатина,
сульфаниловая кислота в 5 % растворе HCl, 0,5 % раствор NaNO2,
10 % раствор СaCO3.
Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензол-сульфоновой
кислотой соединения вишнево-красного цвета. Диазобензолсульфокислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии
сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой
среде:
23
SO
3
H
NH
2
NaNO
2
HCl
NaCl
2 H
2
O
SO
3
N
+
N
_
сульфаниловая кислота 4-диазобeнзолсульфокислота
SO
3
N
+
N
+
HC NH
2
COOH
CH
2
_
N
N
H
CH
COOH
NH
2
SO
3
H
N
N
SO
3
H
N N
N
N
H
CH
2
гистидин
Ход работы: к 1 мл раствора сульфаниловой кислоты в 5 % растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5 % раствора нитрита
натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл
разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10 % раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание. Реакцию проводить осторожно, так как при резком смешивании реактивов
содержимое пробирки может выплеснуться!
Опыт 5. Реакция на аминокислоты,
содержащие «слабосвязанную серу» (реакция Фоля)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, лакмусовая бумажка, спиртовка, держатель для
пробирок, разбавленный раствор белка, раствор желатина, 10 % раствор (СH3COO)2Pb, 30 % раствор NaOH.
24
Реакция основана на способности белков, содержащих цистин и
цистеин, в щелочной среде при нагревании образовывать сульфид
натрия (Na2S), который с плюмбитом натрия дает бурое окрашивание:
Ход работы: в пробирку наливают 1 мл неразбавленного белка,
добавляют двойной объем 30 % раствора NaOH и кипятят смесь
(осторожно, жидкость может выплеснуться!). При этом выделяется
аммиак, который может быть обнаружен по запаху и по посинению
влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки
(не касаясь стенки!). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипячении. Далее добавляют 5–6 капель (СH3COO)2Pb.
Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца (II):
(CH3COO)2Pb + 2NaOH →Pb(ONa)2 + 2 CH3COOH
Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O → PbS↓ + 4NaOH
Черный осадок
Опыт 6. Реакции на триптофан
(реакция Адамкевича — Гопкинса — Коля)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, спиртовка, держатель для пробирок, разбавленный
раствор белка, раствор желатина, СН3СООН (конц.), 7 % раствор
CuSO4, Н2SO4 (конц.).
25
Индольное кольцо триптофана в кислой среде реагирует
с альдегидами, образуя окрашенные продукты конденсации. Чаще
всего для выявления триптофана используют реакцию Адамкевича —
Гопкинса — Коля с глиоксиловой кислотой. Реакция основана на способности триптофана в кислой среде реагировать с глиоксиловой
кислотой с образованием соединения, окрашенного в краснофиолетовый цвет.
При нагревании две молекулы триптофана (I) взаимодействуют
с глиоксиловой кислотой (II) с образованием окрашенного соединения (III):
Для проведения реакции используют ледяную (концентрированную) уксусную кислоту, в которой всегда в небольшом количестве
присутствует глиоксиловая кислота. В качестве водоотнимающего
средства в реакции используется концентрированная серная кислота.
Ход работы: к 1 мл раствора белка приливают 1 мл СН3СООН
(конц.), 2 капли 7 % раствора CuSO4, перемешивают и осторожно
нагревают до растворения выпавшего осадка, после чего содержимое
26
пробирки охлаждают. Далее осторожно по стенке, наклонив пробирку, приливают 2–3 мл Н2SO4 (конц.) (следя за тем, чтобы жидкости не
смешивались). При стоянии на границе двух слоев появляется красно-фиолетовое кольцо, которое постепенно распространяется на весь
раствор. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в
кипящую водяную баню.
Опыт 7. Реакции на триптофан
(реакция Щульце — Распайля)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, разбавленный раствор белка, раствор желатина,
10 % раствор фруктозы, H2SO4, (конц.).
Реакция основана на способности триптофана реагировать
с оксиметилфурфуролом, образующимся из фруктозы в сильнокислой
среде. Продукт конденсации оксиметилфурфурола и триптофана имеет темно-красный цвет.
Ход работы: к 1 мл раствора белка добавляют 2 капли 10 %
раствора фруктозы и перемешивают. Далее осторожно по стенке пробирки вносят 10 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей образуется окрашенное кольцо.
27
Опыт 8. Реакции на триптофан
(реакция Вуазене)
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, стеклянная
палочка, пипетка, лакмусовая бумажка, спиртовка, держатель для
пробирок, разбавленный раствор белка, раствор желатина, 2,5 % раствор формальдегида, HCl (конц.), 0,5 % раствор NaNO2.
Реакция Вуазене протекает только с теми белками, которые содержат в своем составе триптофан. Химизм реакции аналогичен химизму реакции Адамкевича — Гопкинса — Коля: и в том и в другом
случае в конденсацию с триптофаном вступает формальдегид.
Ход работы: к 2 мл разбавленного раствора белка прибавляют
1 каплю 2,5 % раствора формальдегида. Смешивают и прибавляют
6 мл HCl (конц.) удельного веса не менее 1,175, после этого снова перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 10 капель 0,5 % раствора
NaNO2, тщательно перемешивают. Развивается интенсивное синефиолетовое окрашивание.
Контрольные вопросы и задания
1. Аналогичным образом проведите реакции с раствором жела-
тина или с другими растворами белка.
2. Заполните табл. 2.
Таблица 2
Цветные реакции на функциональные группы белков
Наименование
реакции
Используемые
реактивы
Исследуемый
белок
Наблюдаемая
окраска
Чем обусловлена
реакция
Пример:
Биуретовая
реакция
NaOH,
CuSO4
Альбумин
Желатин
Фиолетовая
Ф
иолетовая
Взаимодействием
ионов меди
с пептидными
группировками
и т. д.
28
3. Все проведенные выше реакции запишите в тетради и вы-
полните в цвете.
4. Объясните, чем обусловлено появление желтых пятен на ко-
же при попадании на нее азотной кислоты (конц.).
5. Укажите, в чем заключается значение цветных реакций на
белки.
6. Перечислите, с какими веществами положительна биуретовая
реакция.
7. Подумайте, дает ли смесь свободных аминокислот биурето-
вую реакцию.
8. Какие аминокислоты дают ксантопротеиновую реакцию?
9. Как обнаружить серосодержащие аминокислоты в белке?
10. Что можно обнаружить нингидриновой реакцией?
11. Дают ли нингидриновую реакцию β-аминокислоты?
12. Какие реакции характерны для всех белков?
2.2. СТРОЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
Лабораторная работа № 1.
Исследование денатурации белков
Цель работы — ознакомиться с основными методами осаждения белков (диализом, высаливанием).
Обладая разнообразными заместителями R, белки вступают во
взаимодействие со многими соединениями (кислотами, ионами металлов, спиртами и т. п.) либо конкурируют с ними за молекулы растворителя (воды). Во многих случаях результатом указанных процессов являются переход белков в нерастворимое состояние, выпадение
их в осадок.
29
Денатурация белка — нарушение нативной пространственной
структуры белковой молекулы (разрушение четвертичного, третичного и вторичного уровней организации). Денатурация приводит к изменению биологических и физико-химических свойств белка (в частности, его растворимости). При этом белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима,
но в ряде случаев удаление денатурирующих факторов приводит к
восстановлению исходной конформации молекулы белка и его природных свойств — ренатурации.
Опыт 1. Высаливание белка
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, (NH4)2SO4 (сух.).
Высаливание — это процесс осаждения белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (Na2SO4, NaCl, KCl, MgSO4,
МgСl2 и др.). Этот процесс является обратимым и сохраняет нативные свойства белков. Высаливание можно проводить также и
нейтральными солями, например (NH4)2SO4. Все вещества этого типа
нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию,
что ведет к осаждению белка без изменения нативной структуры.
Белки отличаются друг от друга зарядом и гидрофильностью, поэтому можно разделить белки, используя для их осаждения разные концентрации солей.
Ход работы: к 1 мл раствора белка прибавляют кристаллический сернокислый аммоний ((NH4)2SO4) до насыщения. При этом белок выпадает в осадок. Обратимость процесса высаливания (растворения осадка белка) можно проверить добавлением дистиллированной воды.
30
Опыт 2. Денатурация белка
солями тяжелых металлов
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, 7 % раствор CuSO4, 10 % раствор (CH3COO)2Pb.
Катионы тяжелых металлов образуют прочные связи
с полярными группами белка, в результате чего разрушается пространственная структура и происходит осаждение денатурированного
белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме
AgNO3 и HgCI2) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за адсорбции иона металла и приобретения вследствие
этого белковой молекулой положительного заряда.
Ход работы: в две пробирки налить по 1–2 мл исследуемого
раствора белка и медленно, по каплям при встряхивании прибавить в
одну из них 7 % раствор CuSO4, а в другую — 10 % раствор
(CH3COO)2Pb. Образуется хлопьевидный осадок вследствие образо-
вания малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди —
голубого цвета, с солью свинца — белого). При избытке реактива
осадок снова растворяется.
Опыт 3. Денатурация белка концентрированными
минеральными кислотами
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, HNO3, HCl, H2SO4 (конц.).
Минеральные кислоты вызывают нейтрализацию зарядов белковых молекул, что приводит к денатурации и осаждению белка. При
избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется (за счет перезарядки белка).
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]