Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биохимии. Статическая биохимия. Практикум для СПО
.pdf
31
Ход работы: в три сухие пронумерованные пробирки, стоящие
в штативе, пипетками осторожно налить по 1–2 мл соответственно
HNO3, HCl, H2SO4 (конц.). Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке прилить в них из пипетки по 0,5 мл исследуемого
раствора белка так, чтобы он не смешивался с кислотой. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок
белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии азотной
кислоты, увеличивается, а осадки, выпавшие под действием соляной
или серной кислот, растворяются в их избытке.
Если в работе используют раствор желатина, то следует учесть,
что данный раствор белка не осаждается минеральными кислотами.
Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое
осаждение белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка.
Опыт 4. Денатурация белков спиртом и ацетоном,
основанная на осаждении молекул белка
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, NaCl (кристаллический), спирт.
Кратковременное воздействие спирта на холоде не нарушает
структуры белка, при комнатной температуре происходит денатурация белка.
Ход работы: в пробирку наливают 1–1,5 мл раствора белка
и добавляют немного кристаллического NaCl. Прилить постепенно 5–
6 мл этилового спирта. Выпадает хлопьевидный осадок белка вследствие дегидратации белковых молекул при добавлении спирта.
32
Опыт 5. Денатурация белка фенолом и формалином
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, фенол, формалин.
Фенол и формалин вызывают необратимую денатурацию белка:
образуются малорастворимые продукты конденсации, уплотняется
его консистенция, резко снижается растворимость и т. д. На этом основано применение фенола и формалина для дезинфекции, так как
эти вещества вызывают денатурацию белков живых клеток и, следовательно, их отмирание.
Ход работы: в две пробирки, содержащие по 1–2 мл раствора
белка, пипеткой добавить в первую — равный объем раствора фенола, а во вторую — равный объем формалина. В обеих пробирках выпадает осадок белка, от действия фенола осадок выпадает быстрее.
Опыт 6. Тепловая денатурация белка
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, спиртовки,
держатель для пробирок, пипетки, дистиллированная вода, раствор
белка, 10 % раствор NaOH, 10 % раствор СH3COOH (конц.).
Почти все белки денатурируют при нагревании (+50–55 °С
и выше). Механизм тепловой денатурации связан с усилением теплового движения полипептидных цепей. Это приводит к разрыву водородных и гидрофобных связей. При выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка важную роль играет концентрация водородных ионов. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит
в ИЭТ белка.
33
В сильнокислых (за исключением азотной, трихлоруксусной
и сульфосалициловой кислот) и сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как молекулы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда) и несут в первом случае положительный, во втором случае
отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания и обусловливает
наличие гидратной оболочки вокруг молекулы.
Выпадение белков в осадок при нагревании — свертывание —
характерно почти для всех белков. Исключение составляет желатин,
не свертывающийся при нагревании.
Ход работы: в четыре пронумерованные пробирки наливают по
1 мл раствора белка.
Содержимое пробирки № 1 нагревают (контроль). Жидкость
мутнеет, но, так как частицы денатурированного белка несут заряд,
они удерживаются во взвешенном состоянии (сывороточный альбумин является кислым белком и в нейтральной среде заряжается отрицательно).
В пробирку № 2 добавляют 1 каплю 10 % раствора CH3COOH и
нагревают. Выпадает осадок белка, вследствие того что подавляется
кислотная диссоциация и белок приближается к изоэлектрическому
состоянию.
В пробирку № 3 добавляют несколько капель концентрированной уксусной кислоты и содержимое нагревают. Осадка белка не образуется даже при кипячении, так как в сильнокислой среде молекулы белка перезаряжаются, приобретая положительный заряд.
В пробирку № 4 добавляют 1 каплю 10 % раствора NaOH
и нагревают. Осадок белка не образуется даже при кипячении, так как
в щелочной среде отрицательный заряд на частице белка усиливается.
34
Контрольные вопросы задания
1. Расскажите, что такое денатурация белка. Чем отличается де-
натурированный белок от нативного?
2. Расскажите, при каких условиях и какие вещества вызывают
необратимое осаждение белков. В какой среде белок не свертывается?
3. Подумайте, в чем причина возможности обратимого и необра-
тимого осаждения белка.
4. Укажите практическое применение реакций осаждения белка.
5. На чем основано применение раствора белка при отравлении
солями тяжелых металлов?
6. Приведите схему ступенчатого гидролиза белковой молекулы.
7. Напишите формулу фрагмента структуры белковой молекулы,
состоящего из двух остатков глицина и одного остатка аланина с последовательностью гли-ала-гли.
8. Оформите работу. Проделанные реакции выполните в цвете.
Лабораторная работа № 2.
Высаливание и очистка белка методом диализа
Цель работы — доказать, что низкомолекулярное соединение
NaCl проходит через полупроницаемую мембрану, а высокомолекулярный белок не проходит и остается в диализируемом растворе.
Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных
и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большой молекулярной массой, не
способны проникать через полупроницаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны). При этом низкомолекулярные
частицы (органические и неорганические) легко проходят через поры
полупроницаемых мембран.
35
Диализ широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (соли, сахара и др.), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Прибор, в котором проводят
диализ, называется диализатором. Целлофановый или коллодиевый
мешочек, опущенный в сосуд с водой, представляет простейший диализатор (рис. 1). Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а
низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану в воду.
Методом диализа можно разделить альбумины и глобулины.
При переходе солей из белкового раствора в окружающую среду глобулины будут выпадать в осадок, т. к. они нерастворимы в водной
среде, а альбумины будут оставаться в растворе. Простейшим диализатором может служить целлофановый мешочек, опущенный в стакан
с водой. Солевой раствор белка помещают в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ (ионы соли) диффундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка.
Рис. 1. Схема диализа
Опыт 1. Растворимость альбуминов и глобулинов
Оборудование и реактивы: целлофан, фильтры, плитка, ворон-
ка, пипетка, химический стакан (V = 100 мл), фильтры «Белая лента»,
AgNO3, NaCl (сух.), яичный белок, реактивы для проведения качественных реакций (например, биуретовой и ксантопротеиновой).
36
Альбумины и глобулины являются наиболее распространенными в природных объектах белками. Обычно они встречаются вместе,
и отделение их друг от друга основано на различной их растворимости в воде и различной высаливаемости минеральными солями.
Альбумины растворимы в воде и в крепких растворах солей
(осаждаются лишь при более чем 50 % насыщении раствора солью), а
глобулины растворимы только в растворах солей средней концентрации (8–15 %). В растворах с более высокой и более низкой концентрациями соли растворимость глобулинов уменьшается.
Ход работы:
1. Изготовление диализатора: вырезают из целлофана круг диа-
метром 9–12 см. Складывают его в форме мешочка, вставляют
в стакан так, чтобы верхний конец мешочка выступал на 2–3 см,
а нижний был бы погружен внутрь на 1–3 см. Для удобства мешочек
заполняют водой. Мешочек должен быть помещен так, чтобы он не
касался стенок и дна стакана. Перед работой воду из диализатора выливают.
2. Проведение анализа: с помощью воронки вливают
в диализатор 10 мл (не более половины объема мешочка) раствора
яичного белка, насыщенного NaCl (сух.), и погружают мешочек в
литровый стакан с дистиллированной водой. Через 5–10 мин. отбирают пипеткой немного воды из стакана и проводят реакции на присутствие хлорид-ионов (реакцию с раствором нитрата серебра) и отсутствие белка (биуретовую реакцию или ксантопротеиновую реакцию на белки). Сменив воду в стакане, если реакция на хлорид-ионы
ярко выражена, продолжают диализ, время от времени проверяя реакцию на хлорид-ионы и белок и меняя воду через каждые 5–10 мин.
Через 1,5–2 ч. проба на хлорид-ионы становится отрицательной
или очень слабой. Это свидетельствует о завершении диализа, т. е. о
почти полной диффузии соли из диализатора в наручный раствори-
37
тель. В мешочке к этому времени прозрачный ранее фильтрат мутнеет вследствие выпадения в осадок глобулинов, нерастворимых в дистиллированной воде.
Мешочек вынимают из стакана и содержимое его фильтруют
через бумажный фильтр. На фильтре остаются глобулины, в фильтрат
переходят альбумины. Проводят качественные реакции и доказывают
наличие обоих белков в осадке и фильтрате.
Опыт 2. Высаливание белков сульфатом аммония
Оборудование и реактивы: химический стакан на 100 мл, про-
бирки, фильтр «Белая лента», плитка, воронка, пипетка, держатель
для пробирок, спиртовка, (NH4)2SO4 (порошок), реактивы для проведения качественных реакций (биуретовой и ксантопротеиновой).
Ход работы: в пробирку налить 3–4 мл раствора белка, доба-
вить равный объем насыщенного раствора (NH4)2SO4 и слегка
встряхнуть смесь. Появляется муть от выпавшего осадка глобулинов.
Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр.
Фильтрат разделяют на две части и переносят в пробирки. Первую
пробирку с прозрачным фильтратом нагревают до кипения
и наблюдают свертывание альбуминов, находящихся в растворе. Во
вторую пробирку с фильтратом добавляют при перемешивании избыток (NH4)2SO4 (порошок) до прекращения его растворения. Появляются муть или хлопья выпадающего в осадок альбумина (сравнить с
исходным фильтратом). Осаждение белков солями является обратимым процессом, и при добавлении воды белки снова растворяются.
38
Контрольные вопросы и задания
1. Оформите работы и сформулируйте выводы.
2. Укажите, в чем состоит очистка методом диализа.
3. Подумайте, как доказать, что при диализе белок остается в
диализном мешке, а ионы соли находятся в диализирующей жидкости.
4. Сделайте вывод о распределении низко- и высокомолекуляр-
ных веществ до и после диализа.
Лабораторная работа № 3.
Определение изоэлектрической точки белка
Цель работы — определить изоэлектрическую точку различных
белков при использовании буферных смесей со стандартными значениями рН.
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, пипетки на
1 мл, мерный пальчик, 0,1 % раствор белка, 1 % раствор желатина
(или раствор другого белка), буферные растворы: 0,2 М раствор
СН3СООН, 0,2 М СН3СООNa, этиловый спирт.
Молекулы белков обладают электрическим зарядом, положительным и отрицательным, вследствие наличия в них способных к
ионизации концевых групп –СООН и –NH2, а также боковых групп
дикарбоновых и диаминокислот.
В кислой среде белки имеют суммарный положительный заряд:
HOOC-CHR-NH2 + H+ ↔ HOOC-CHR-NH
3
+
,
а в щелочной — отрицательный:
HOOC-CHR-NH2 + –ОH ↔ –OOC-CHR-NH2 + H2O.
39
При определенном значении рН среды величины положительных и отрицательных зарядов становятся одинаковыми и суммарный
заряд белка оказывается равным нулю (изоэлектрическое состояние
белка). Значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка (ИЭТ).
Заряженность молекулы белка является одним из факторов его
устойчивости в растворах, так как мешает слипанию белковых частиц
и выпадению их в осадок. В ИЭТ растворы белков неустойчивы и
белки легко выпадают в осадок (особенно в присутствии водоотнимающих веществ — этилового спирта, ацетона и др.). Наличие гидратной оболочки у белковой молекулы является другим фактором
устойчивости этих молекул в растворе. Поэтому для определения
ИЭТ белка определяется pH раствора, при котором наблюдается
наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок. Для получения
растворов с различной величиной рН пользуются буферными растворами.
Метод основан на способности растворенного белка в ИЭТ переходить в неустойчивое состояние и выпадать в осадок, что проявляется в помутнении раствора. При добавлении этилового спирта в
качестве водоотнимающего средства ускоряется процесс осаждения
белка.
Ход работы: в шесть пронумерованных пробирок вносят бу-
ферные смеси с разным значением рН (табл. 3).
Содержимое пробирок взбалтывают и в каждую добавляют по
0,5 мл 0,1 % раствора белка. Смесь в пробирках снова встряхивают. В
каждую пробирку добавляют по 1 мл этилового спирта и оценивают
мутность проб. Степень помутнения обозначают так:
«–» — отсутствие помутнения;
«+» — слабое помутнение;
40
«++» — выраженное (или средней степени) помутнение;
«+++» — максимально выраженное помутнение.
ИЭТ белка определяют по значению рН раствора в той пробе,
где наблюдается наиболее сильное помутнение. Результаты заносят в
табл. 3.
Таблица 3
Приготовление буферных систем
для определения ИЭТ белка куриного яйца
№
пробирки
Состав буферной смеси
(мл)
рН
смеси
Раствор
белка,
мл
Этиловый
спирт, мл
Степень
помутнения
0,2 М
СН
3
СООН
0,2 М
CH3COONa
1
1,9
0,1
3,4
0,5 1 2 1,8
0,2
3,8
0,5 1 3 1,4
0,6
4,4
0,5 1 4 1,0
1,0
4,7
0,5 1 5 0,6
1,4
5,1
0,5 1 6 0,2
1,8
5,7
0,5 1
Параллельно с этим проводят серию опытов для 1 % раствора
желатина.
Для определения ИЭТ желатина в шесть сухих пробирок последовательно вносят реактивы в количествах (мл), указанных в табл. 4.
Далее содержимое пробирок перемешивают, приливают медленно по
стенке по 2 мл 96 % спирта (или ацетона). Через 30 мин. определяют
изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать рН
пробирки с максимальной степенью помутнения.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]