Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
Лабораторная работа № 5
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН
НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ КЛЕТКИ
Цель работы – изучить влияние различных факторов на дейст-
вие ферментов.
Задачи работы – освоить методы работы с ферментами; исследовать влияние температуры на активность амилазы, холинэстеразы,
а также влияние рН на активность амилазы; изучить специфичность
амилазы.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Ферменты обладают всеми свойствами белков. Однако по сравнению с белками, выполняющими другие функции в клетке, ферменты имеют ряд специфических, присущих только им свойств.
Зависимость активности ферментов от температуры
Температура может влиять по-разному на активность фермента.
При высоких значениях температуры может происходить денатурация белковой части фермента, что негативно сказывается на его активности. При определённых (оптимальных) значениях температура
может влиять на скорость образования фермент-субстратного комплекса, вызывая увеличение скорости реакции. Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется
температурным оптимумом фермента. Различные клеточные ферменты имеют собственные температурные оптимумы, которые определяются экспериментально. Для ферментов животного происхождения
температурный оптимум находится в интервале 40–50 °С (рис. 5.1).
71
Рис. 5.1. Влияние температуры на активность фермента
Влияние pH среды на активность ферментов
Ферменты, как и любые белки, чувствительны к значению pH
среды. От концентрации водородных ионов (Н+) зависит ионизация
функциональных групп в молекуле белка фермента.
Во-первых, водородные ионы воздействуют на активный центр
фермента. При различных значениях pH в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или
меньше экранирован соседними с ним группами.
Во-вторых, концентрация водородных ионов влияет на состояние
белковой части фермента, определяя соотношение в нём анионных и
катионных групп, что сказывается на третичной структуре. Как известно, именно при формировании третичной структуры фермента
образуются активные центры фермента.
В-третьих, pH среды влияет на степень ионизации субстрата,
фермент- субстратного комплекса и продуктов реакции.
Для каждого фермента существует свое оптимальное значение
pH среды (рНОПТ), при котором его активность максимальна. Например, амилаза наиболее активна при pH 6,8–7,0, а пепсин –
при pH 1,5–2,5.
Изменение pH в кислую или щелочную сторону сопровождается
более или менее равномерным падением активности фермента, как
показано на рис. 5.2.
72
Но воздействие pH ощутимо в гораздо большей степени, чем
влияние температуры. Если ферменты сохраняют жизнеспособность
при изменении температуры на несколько единиц, иногда десятков
градусов, то смещение pH лишь на несколько десятых долей единицы
уже чувствительно для ферментов.
Рис. 5.2. Зависимость активности фермента от значения pH среды:
1 – пепсин; 2 –амилаза; 3 – химотрипсин
Например, оптимум pH крови у человека в норме составляет 7,4.
При уменьшении pH до 7,2–7,3 в результате интенсивной физической
нагрузки ощущаются слабость, тошнота, головокружение. Изменение
pH крови на одну единицу приводит у животных к агонии и смерти.
«Загнать лошадь» – известное выражение, смысл которого всем понятен. Это результат целого комплекса факторов: обезвоживания, гипертермии и др., но сдвиг pH в данном случае – одна из первоочередных причин, приводящая к инактивации ферментных систем и прекращению биохимических реакций.
Особо показательно изменение pH для ферментных систем микроорганизмов. Например, бактериостатический эффект обычного хозяйственного мыла объясняется его щелочной реакцией. Многие очаговые бактериальные заболевания удаётся купировать простыми
средствами: полосканиями и ваннами с кислыми (перманганат калия)
и щелочными (питьевая сода) средствами.
73
Показатель pH – это мощный инструмент и в руках специалистов-технологов, производящих пищевую продукцию. Широко распространённые способы консервирования грибов, ягод, овощей,
фруктов, мясных и рыбных продуктов – это подкисление среды с помощью уксусной и лимонной кислот [1, 3, 4].
Специфичность действия ферментов
Специфичность – это избирательность фермента по отношению
к субстрату (или субстратам). Специфичность действия ферментов
объясняется тем, что субстрат должен подходить к активному центру
как «ключ к замку». Это образное сравнение сделано Э. Фишером
в 1894 г. Он рассматривал фермент как жёсткую структуру, активный
центр которой представляет собой «слепок» субстрата. Однако этой
гипотезой трудно объяснить групповую специфичность ферментов,
так как конфигурация «ключей» (субстратов), подходящих к одному
«замку», слишком разнообразна. Такое несоответствие получило объяснение в 50-е гг. XX в. в гипотезе Д. Кошланда. Она получила название гипотезы «вынужденного соответствия».
По гипотезе Д. Кошланда молекула фермента не жёсткая, а гибкая и эластичная, поэтому информация фермента и его активного
центра может изменяться при присоединении субстрата или других
лигандов. В момент присоединения (рис. 5.3) субстрат «вынуждает»
активный центр фермента принять соответствующую форму. Это
можно сравнить с «перчаткой» и «рукой».
Гипотеза «вынужденного соответствия» получила экспериментальное подтверждение. Эта гипотеза позволяет также объяснить
причину превращения близких аналогов субстратов.
Различают несколько видов специфичности.
Стереохимическая субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера субстрата. Например, фумаратгидратаза катализирует присоединение молекулы
воды к кратной связи фумаровой кислоты, но не к её стереоизомеру –
малеиновой кислоте.
74
Абсолютная субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата. Например, уреаза катализирует гидролиз только мочевины.
Групповая субстратная специфичность – фермент катализирует
превращение группы субстратов сходной химической структуры. Например, алкогольдегидрогеназа катализирует превращение этанола и
других алифатических спиртов, но с разной скоростью.
Влияние на активность ферментов активаторов и ингибиторов
К числу факторов, повышающих активность ферментов, относятся катионы металлов и некоторые анионы. Чаще всего активаторами
ферментов являются катионы Mg2+, Mn2+, Zn2+, K+ и Со2+, а
из анионов – Сl-. Катионы действуют на ферменты по-разному. В одних случаях они облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в других – способствуют присоединению кофермента к апоферменту, либо присоединяются к аллостерическому центру фермента и изменяют его третичную структуру, в результате чего субстратный и каталитический центры приобретают наиболее выгодную для
осуществления катализа конфигурацию.
Ингибиторы тормозят действие ферментов. Ингибиторами могут
быть как эндогенные, так и экзогенные вещества. Механизмы ингибирующего действия различных химических соединений разнообразны [1, 3, 4].
Рис. 5.3. Взаимодействие субстрата с ферментом согласно модели
«вынужденного соответствия»
75
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Влияние температуры на активность амилазы слюны
Материалы и оборудование
1. Слюна.
2. 1 %-ный раствор крахмала.
3. Реактив Люголя.
4. Дистиллированная вода.
5. Пипетки вместимостью 1 мл.
6. Штатив с пробирками.
7. Термостат.
8. Спиртовка.
9. Ледяная баня.
10. Предметные стёкла.
Ход работы
В 4 пробирки наливают по 0,5 мл крахмала. Ещё в 4 пробирки
наливают по 0,5 мл разбавленной (1 : 5) слюны. Берут первую пару
пробирок (одна с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают
в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (37 °С), а четвёртую
– в кипящую водяную баню. Через 5 мин содержимое каждой пары
пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют
стоять ещё 10 мин при тех же условиях. Из третьей пробирки отливают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода
на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют
стоять ещё 10 мин и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Потом добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки
и наблюдают за развитием окраски.
Результаты записывают в табл. 5.1. Делают выводы о характере
влияния температуры на активность амилазы.
76
Влияние температуры на активность холинэстеразы
№ пробирки
Температура инкубация, °С
Окрашивание с йодом
1
0
2 20
3 37
4 100
Холинэстераза – фермент, играющий существенную роль в процессе передачи возбуждения холинэргическими нервами на воспринимающие ткани. Холинэстераза расщепляет ацетилхолин – медиатор
нервного возбуждения – на холин и уксусную кислоту:
(CH3)3 +NCH2CH2-O-CO-CH3→(CH3)3 +NCH2CH2-OH +
+ CH3COOH
Таблица 5.1
Результаты эксперимента
В процессе реакции происходит закисление среды за счёт накопления уксусной кислоты, что можно обнаружить с помощью индикатора.
В работе используется двухцветный индикатор бромтимоловый синий.
Зона смены окраски находится в области рН 7,6–6,0; в кислой среде окраска жёлтая, в щелочной – синяя, если среда промежуточная, то окраска зелёная. Инкубацию фермента и субстрата проводят в различных
температурных условиях. Об интенсивности ферментативного гидролиза ацетилхолина судят по окраске инкубационной смеси.
Материалы и оборудование
1. Сыворотка крови (разведение 1:50) – источник холинэстеразы.
2. 0,5 %-ный раствор ацетилхолина (готовят на дистиллирован-
ной воде, освобождённой от СО2).
3. 0,02 %-ный раствор бромтимолового синего (2,5 г сухого индикатора растирают в ступке в 4,5 мл 0,1 М раствора; полученный
раствор переносят в мерную колбу на 50 мл, добавляют 12,5 мл 0,1 М
раствора борной кислоты, приготовленного на 0,1 М растворе KCl;
77
раствор доводят водой до метки, перед опытом раствор разводят во-
№ пробирки
Температура инкубация, °С
Окрашивание с йодом
1
0
2 20
3 37
4 100
дой в 2 раза).
4. Пипетки вместимостью 1 мл и 5 мл.
5. Штатив с пробирками.
6. Термостат.
7. Ледяная баня.
Ход работы
Берут 3 пробирки. Вносят в каждую по 2,5 мл сыворотки крови и
по 0,5 мл бромтилового синего. Одну из пробирок помещают в термостат (37 °С), вторую оставляют при комнатной температуре, третью помещают в ледяную баню. Через 5 мин, необходимых для выравнивания температуры, во все 3 пробирки вносят по 0,5 мл раствора ацетилхолина. Содержимое пробирок перемешивают и вновь оставляют в соответствующих температурных условиях. Через 10–
15 мин отмечают цвет в каждой пробирке.
Результаты записывают в табл. 5.2. Делают выводы о зависимости скорости реакции от температуры.
Таблица 5.2
Результаты эксперимента
Влияние рН на активность амилазы слюны
Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при
взаимодействии с крахмалом при различных значениях рН среды.
О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала
с раствором йода. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (отсутствует йод). По мере удаления
78
от оптимума рН в кислую или щелочную зоны расщепление крахмала
№ пробирки
рН
Окрашивание с йодом
1
5,5
2
6,5
3
7,0
4 8,0
произойдет только частично, до стадии декстринов, или крахмал вообще не подвергнется расщеплению.
Материалы и оборудование
1. Слюна.
2. 1 %-ный раствор крахмала.
3. Реактив Люголя.
4. 1/15 М растворы фосфатного буфера с разными значениями
рН (5,5–8,0).
5. Пипетки вместимостью 1 мл.
6. Штатив с пробирками.
7. Термостат.
Ход работы
Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл крахмала, 0,5 разбавленной
(1 : 5) слюны. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 мл буфера с
рН = 5,8, во вторую пробирку – 0,5 мл буфера с рН = 6,5, в третью –
0,5 мл буфера с рН = 7,0, в четвёртую – 0,5 мл буфера с рН = 8,0. По-
мещают все пробирки на 10 мин в термостат (37 °С). После этого добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки и наблюдают
за развитием окраски.
Результаты записывают в табл. 5.3. Делают выводы о характере
влияния рН на активность амилазы.
Таблица 5.3
Результаты эксперимента
79
Специфичность действия α-амилазы слюны
№ пробы
Амилаза
сл юны, мл
Крахмал, мл
Сахароза, мл
Реакция
Троммера
(+, -)
Реакция
с йодом
(+, -)
1 1 1 –
2 1 – 1
α-амилаза катализирует гидролитическое расщепление крахмала
с образованием мальтозы. Промежуточными продуктами в данной
реакции являются различные декстрины (амино-, эритро-, ахро- и
мальтодекстрины). Степень гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с йодом. Крахмал даёт с йодом синее окрашивание декстрины, в зависимости от размера молекул, при взаимодействии с йодом окрашиваются в разные цвета (сине-фиолетовый,
красно-бурый, жёлто-бурый), а конечные продукты с йодом окраски
не дают. Второй контрольной пробой может быть реакция на наличие
свободных альдегидных групп.
Материалы и оборудование
1. Слюна.
2. 1 %-ный раствор крахмала.
3. 1 %-ный раствор сахарозы.
4. 10 %-ный раствор NaOH.
5. 1 %-ный раствор CuSO4.
6. Реактив Люголя.
7. Пипетки вместимостью 1 мл.
8. Штатив с пробирками.
9. Термостат.
Ход работы
Готовят 2 инкубационные пробы, как указано в таблице, используя в качестве субстратов для амилазы 2 вещества: крахмал
и сахарозу (табл. 5.4).
Таблица 5.4
Результаты эксперимента
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]