Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
ферментов секретирует в кишечник поджелудочная железа. Это
трипсин и химотрипсин, гидролизующие белки; липаза, расщепляющая жиры; амилаза, катализирующая расщепление крахмала. Пепсин,
трипсин и химотрипсин секретируются в неактивной форме, в виде
так называемых зимогенов (проферментов), и переходят в активное
состояние только в желудке и кишечнике. Это объясняет, почему указанные ферменты не разрушают клетки поджелудочной железы и желудка. Стенки желудка и кишечника защищает от пищеварительных
ферментов и слой слизи. Некоторые важные пищеварительные ферменты секретируются клетками тонкого кишечника.
Большая часть энергии, запасённой в растительной пище, такой
как трава или сено, сосредоточена в целлюлозе, которую расщепляет
фермент целлюлаза. В организме травоядных животных этот фермент
не синтезируется, и жвачные, например крупный рогатый скот и овцы, могут питаться содержащей целлюлозу пищей только потому, что
целлюлазу вырабатывают микроорганизмы, заселяющие первый отдел желудка – рубец. С помощью микроорганизмов происходит переваривание пищи и у термитов.
Ферменты находят применение в пищевой, фармацевтической,
химической и текстильной промышленности. В качестве примера
можно привести растительный фермент, получаемый из папайи и используемый для размягчения мяса. Ферменты добавляют также в стиральные порошки.
Применение ферментов
Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к широкому их применению в медицине и сельском хозяйстве. Нормальное функционирование любого растительного и животного организма зависит от эффективной работы ферментов. В основе действия многих токсичных веществ (ядов) лежит их способность ингибировать ферменты; таким же эффектом обладает и ряд
лекарственных препаратов. Нередко действие лекарственного препарата или токсичного вещества можно проследить по его избирательному влиянию на работу определенного фермента в организме в це-
61
лом или в той или иной ткани. Например, мощные фосфорорганические инсектициды и нервно-паралитические газы, разработанные
в военных целях, оказывают свой губительный эффект, блокируя работу ферментов – в первую очередь холинэстеразы, играющей важную роль в передаче нервного импульса.
Чтобы лучше понять механизм действия лекарственных препаратов на ферментные системы, полезно рассмотреть, как работают некоторые ингибиторы ферментов. Многие ингибиторы связываются
с активным центром фермента – тем самым, с которым взаимодействует субстрат. У таких ингибиторов наиболее важные структурные
особенности близки к структурным особенностям субстрата, и если в
реакционной среде присутствуют и субстрат и ингибитор, между ними наблюдается конкуренция за связывание с ферментом; причём чем
больше концентрация субстрата, тем успешнее он конкурирует с ингибитором. Ингибиторы другого типа индуцируют в молекуле фермента конформационные изменения, в которые вовлекаются важные
в функциональном отношении химические группы. Изучение механизма действия ингибиторов помогает химикам создавать новые лекарственные препараты.
Ферменты как катализаторы:
1) не вызывают каких-либо реакций, невозможных по термоди-
намическим законам;
2) увеличивают скорость как прямой, так и обратной реакции об-
ратимого химического процесса;
3) остаются химически неизменимыми;
4) в очень малых количествах способны превращать несоизмери-
мо большие массы субстратов.
Согласно современным представлениям ферменты увеличивают
скорость химической реакции, снижая энергетический барьер данной
реакции. Ведущую роль в механизме ферментативного катализа играют промежуточные фермент-субстратные комплексы, образование
62
которых определяется тонкой структурой активного центра и уникальной структурой всей молекулы фермента.
Ферменты делят на простые и сложные.
У простых функции контактных и каталитических групп активного центра определяются только радикалами аминокислотных остатков, у сложных ферментов активный центр включает также коферменты и ионы металлов.
Все ферменты делят на шесть классов, в зависимости от типа
реакций, ими катализируемых:
1) оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-
восстановительные реакций;
2) трансферазы – ферменты, катализирующие реакции переноса
различных групп;
3) гидролазы – ферменты, ускоряющие реакции гидролаза;
4) лиазы – ферменты, отщепляющие от субстрата определённые
группы негидролитическим путём с образованием двойной связи или
наоборот, присоединяющие группы к двойной связи;
5) изомеразы – ферменты, ускоряющие реакции изомеризации;
6) лигазы (синтетазы) – ферменты, катализирующие реакции синтеза.
В реакциях, катализируемых оксидоредуктазами, окисляемый
субстрат является донором водорода или электронов. Роль акцептора
могут выполнять различные соединения: коферменты NAD(P), FMN,
FAD, CoQ, O2, органические соединения, цитохромы, ксенобиотики.
Для большинства ферментов этой группы рекомендуемые названия –
дегидрогеназы или редуктазы. Когда акцептором служит O2, используется термин оксидаза; если O2 внедряется в субстрат, фермент называется оксигеназой. Пероксидаза – фермент, который утилизирует
H2O2 как акцептор. Каталаза – фермент, способный катализировать
реакцию, в которую вовлекается донор-акцепторная пара, представленная двумя молекулами перекиси водорода [3, 4].
Каталаза и пероксидаза играют важную роль в работе системы
антиоксидантной защиты. Эти ферменты активируют процесс разложения пероксида водорода. Пероксид водорода является одной из ак-
63
тивных форм кислорода, повреждающей многие важные системы
клетки (мембраны, электронтранспортные цепи, ферменты и т.д.).
К пероксидазам относят группу ферментов, использующих в качестве окислителя пероксид водорода: НАДН-пероксидазу, НАДФНпероксидазу, глутатион-пероксидазу, гваякол-пероксидазу, аскорбатпероксидазу и др.
Все они работают по схеме:
АН2 + Н2 О2 → А + 2Н2 О.
Обнаружено, что пероксидазы обеспечивают нормальный ход
окислительных процессов при различного рода неблагоприятных
воздействиях на живые организмы, например, при воздействии патогенных агентов, тяжёлых металлов и др.
Пероксидаза образует с пероксидом водорода комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и приобретает
способность действовать как акцептор водорода. Обнаружение пероксидазы основано на изменении окраски при окислении полифенолов в хиноны.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Качественная реакция на каталазу
Каталаза – фермент, широко распространённый в клетках как животных, так и растительных организмов. Каталаза обнаружена у всех
аэробных организмов и у некоторых факультативных анаэробов. Подобно пероксидазе и цитохромоксидазе, каталаза относится
к Fe-порфириновым ферментам. Сущность каталитического действия
каталазы состоит в разложении пероксида водорода с выделением
молекулярного кислорода. Реакция с участием каталазы требует двух
молекул пероксида водорода, из которых одна действует как донор, а
другая – как акцептор электронов. Механизм каталитической реакции
можно представить следующим образом:
2Н2 О2 → 2Н2 О + О2,
FeОН + НООН → FeООН + Н2 О,
64
FeООН + НООН → FeОН + Н2 О + О2.
Материалы и оборудование
1. Картофельный сок.
2. 3 %-ный раствор H2O2.
3. Штатив с пробирками.
4. Пипетки вместимость 1 мл.
Ход работы
Для обнаружения каталазы в картофельном соке очищенный
от кожуры картофель натереть на терке, затем отжать через марлю,
сок собрать в пробирку. Внести 10 капель сока в пробирку с очень
слабым раствором Н2О2 (5 мл воды и 10 капель 3 % пероксида водорода). Пронаблюдать за реакцией в пробирке. То же самое проделать
с предварительно прокипячённой порцией сока.
Качественная реакция на гидролазы
Ферменты класса гидролаз катализируют реакции распада химических соединений. Причём эти реакции идут с присоединением элементов воды. Действие гидролитических ферментов обратимо. Все
ферменты пищеварительного тракта, ускоряющие переваривание
белков, жиров, и углеводов, относятся, относятся к классу гидролаз.
Пепсин – протеолитический фермент, относящийся к классу гидролаз, подклассу пептидогидролаз. Особенностью действия пепсина является то, что оптимум действия фермента находится при рН 1,5–2,5, т.е.
он максимально активен в сильнокислой среде. Протеолитическую активность фермента можно пронаблюдать, добавив к подкислённому
раствору небольшое количество белка фибрина. Фибрин, нерастворимый в воде, под действием пепсина растворяется (происходит ферментативный гидролиз фиброина до растворимых в воде пептидов).
Материалы и оборудование
1. Фибрин.
2. Раствор пепсина.
65
3. Штатив с пробирками.
4. Пипетки вместимостью 1 мл.
5. Термостат.
Ход работы
В пробирку наливают 0,5 мл раствор пепсина и опускают небольшой комочек фибрина. Обе пробирки помещают в термостат
(37 °С) на 1 ч. Наблюдают растворение фибрина.
Качественная реакция на липазу
Липаза – один из ферментов подкласса 1 класса гидролаз. Ферменты, входящие в состав этого подкласса, в присутствии воды действуют на сложноэфирной связи. Липаза катализирует гидролаз нейтрального жира.
Липазу можно открыть, добавив её раствор к молоку, содержащему
эмульгированный жир. Полеченную смесь подщелачивают раствором
карбоната натрия до бледно-розовой окраски (на фенолфталеин).
В присутствии липазы происходит гидролитическое расщепление
жира на глицерин и жирные кислоты, реакция среды при этом сдвигается в кислую сторону, розовая окраска исчезает.
Материалы и оборудование
1. Молоко.
2. Раствор спиртоосаждённой липазы с массовой долей 1 %.
3. Глицериновая вытяжка панкреатической липазы (поджелудоч-
ную железу животного измельчают, заливают глицерином и выдерживают в холодильнике в течение суток. Осторожно сливают глицерин или отфильтровывают).
4. Дистиллированная вода.
5. 1 %-ный раствор фенолфталеина.
6. 1 %-ный раствор карбоната натрия.
7. Штатив с пробирками.
8. Пипетки вместимостью 1 мл.
9. Термостат.
66
Ход работы
Проводится качественная реакция на жирные кислоты, образующиеся при ферментативном гидролизе жира молока. Для этого в две
пробирки наливают по 5 см3 предварительно прокипячённого и охлаждённого молока. Далее добавляют по одной капле спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1 % и осторожно (по каплям)
раствор карбоната натрия с массовой долей 1 % до розовой окраски.
После этого в одну пробирку вносят 1 см3 раствора липазы, в другую –
1 см3 предварительно прокипячённого и охлаждённого раствора фер-
мента. Обе пробирки ставят на 25–30 мин в термостат при 37 С.
Наблюдают за изменением окраски в пробирках, делают выводы.
В первой пробирке розовая окраска исчезает вследствие связывания избыточной щёлочи образующимися жирными кислотами:
RCOOH + Na2CO3 = RCOONa + NaHCO3.
Во второй пробирке окраска не изменяется (остается розовая)
ввиду отсутствия реакции гидролиза (фермент инактивирован нагреванием).
Определение активности каталазы
Каталаза – это двухкомпонентный фермент, состоящий из белка
и соединённой с ним простетической группы. Кристаллическая каталаза содержит 0,09 % железа, что соответствует четырём его атомам
на молекулу. Каталаза всегда присутствует в системах, где происходят процессы клеточного дыхания с участием флавиновых дегидрогеназ, в результате деятельности которых образуется токсичная для
клетки перекись водорода. Поэтому каталаза выполняет важную
роль, разлагая токсичную для клеток перекись водорода. Кроме того,
весьма существенной должна быть признана роль каталазы в снабжении молекулярным кислородом тех участков ткани, куда доступ его
в силу тех или иных причин затруднён. Например, ткани перикарпия
сочных плодов, многослойная паренхима и др. Активность фермента
зависит от вида растения, возраста клеток, типа ткани и других фак-
67
торов. Методы, используемые для определения активности каталазы,
основаны, главным образом, на количестве кислорода, образующегося в результате действия фермента.
Определение активности каталазы титриметрическим методом
Этот метод анализа получил название перманганатометрия
и используется для определения веществ, обладающих восстановительными свойствами, в данном случае H2O2.
Материалы и оборудование
1. 0,3 %-ный раствор перекиси водорода.
2. 10 %-ный раствор серной кислоты.
3. 0,05 н перманганат калия; водяная баня.
4. Бюретка для титрования; ступки; пестики.
5. Колбы на 50 мл (5 шт.).
6. Стаканы для титрования (15 шт.).
Ход работы
Навеску растительного материала (100–200 мг) растирают
в ступке с водой, переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Растительную вытяжку фильтруют,
берут 5 мл отфильтрованного гомогената и инкубируют 10 мин с 5 мл
0,3 %-ного раствора перекиси водорода.
Инкубацию прекращают, добавляя 5 мл 10 %-ной серной кислоты. Неразложившуюся перекись водорода оттитровывают 0,05 н раствором KMnO4 до появления слабо розовой окраски, не исчезающей
в течение 1 мин:
5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2.
Контрольную пробу гомогената для инактивации фермента предварительно прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин, затем добавляют 5 мл 0,3 %-ного раствора перекиси водорода, инкубацию прекращают добавлением серной кислоты. Оттитровывают перекись водорода перманганатом калия.
68
Активность каталазы рассчитывают по формуле
,
где К – количество KMnO4, пошедшего на титрование в контроле, мл;
О – количество KMnO4, пошедшего на титрование в опыте, мл;
0,85 – количество мл H2O2, соответствующее 1 мл 0,05 н KMnO4;
Т – время инкубации (10 мин); Е – разведение.
Активность каталазы выражают в количестве O2, образовавшегося в результате действия фермента за 1 мин на 1 г сырой массы
(мл О2 г-1·мин-1).
Определение активности каталазы по методике М.А. Королюка
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать
с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Материалы и оборудование
1. 4 %-ный раствор молибдата аммония.
2. 0,3 %-ный раствор перекиси водорода.
3. Молоко.
4. Пипетки вместимостью 1, 2 мл.
5. Штатив с пробирками.
6. Фотоколориметр, кюветы.
Ход работы
Реакция запускается добавлением 0,1 мл молока к 2 мл 0,03 %
раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо молока вносят
0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 мин
добавлением 1 мл 4 % молибдата аммония. Интенсивности развивающейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны
410 нм против контрольной пробы, которую вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Активность каталазы сыворотки рассчитывают по формуле
(мкат/л),
69
где Е – активность каталазы (в мкат/л); А
и Аоп – экстинкция холо-
хол
стой и опытной проб; V – объём вносимой пробы 0,1 мл; t – время инкубации 600 с; К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 22,2*103 мМ-1*см-1.
Единицы измерения в методике определения содержания каталазы – нмоль /л.
Контрольные вопросы
1. Что такое ферменты? Каковы их функции в клетке?
2. Какой принцип положен в основу классификации ферментов? Назовите
основные классы ферментов.
3. Каковы основные свойства ферментов?
4. Перечислите классы ферментов, которые играют наиболее значимые ро-
ли в инструментарии молекулярной биотехнологии?
5. Каков механизм действия ферментов?
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]