Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
структуры клетки, оболочка, т.е. всё, что построено с участием белков. Клетка – биосистема. Нарушение или изменение функций одной
части неминуемо ведёт за собой перемены во всей биосистеме. Так
же как и клетка формирует ткани, ткани формируют органы, органы –
системы органов, все вместе – организм. Нарушение в структуре ДНК
может проявиться как в незначительном масштабе, так и на всём организме в целом [5].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование
1. Ткани говядины.
2. Альбумин бычий.
3. 0,3 М, 0,5 М, 0,6 М растворы HClO4.
4. 0,6 M раствор KOH;.
5. Биуретовый реактив (0,15 г CuSO4·5Н2О и 0,6 г виннокислого
натрий-калия (сегнетова соль) растворяют в 50 мл дистиллированной
воды, при энергичном перемешивании приливают 30 мл 10 %-ного
раствора NaOH, свободного от Na2CO3; добавляют 0,1 г KI и доводят
водой до 100 мл).
6. Штатив с пробирками.
7. Пипетки вместимостью 1,2 мл.
8. Фотоэлектроколориметр, кюветы с длиной оптического пути
5 мм, спектрофотометр.
9. Кипящая ледяная и водяная бани.
10. Центрифуга, центрифужные пробирки.
11. Фильтровальная бумага, воронка.
12. Стеклянная палочка.
13. Колбы с притертыми пробками.
14. Обратный холодильник.
15. Термостат.
16. Нож, разделочная доска.
17. Блендер.
91
Ход работы
Определение проводят строго на холоде в центрифужных пробирках, ставя 4–5 параллельных проб.
К 0,1 мг гомогената добавляют 1,9 мл 0,3 М раствора HClO4. Для
полноты осаждения кислотонерастворимой фракции пробирки
на 15 мин помещают в лёд. Затем центрифугируют при 3000 об/мин
в течение 10–15 мин. Осадки дважды отмывают 0,2 М раствором
HClO4. После последнего центрифугирования стенки пробирки тща-
тельно подсушивают фильтровальной бумагой, чтобы избежать загрязнения фракции кислотонерастворимым материалом, имеющимся
в надосадочной жидкости.
Осадки суспендируют, предварительно растерев стеклянной палочкой в 0,5 мл воды; затем добавляют при комнатной температуре
0,5 мл 0,6 М раствора КОН. Суспензия при этом светлеет. Если осадок суспендировать непосредственно в 0,6 М растворе КОН, быстро
образуется желатиноподобный осадок, который не растворяется даже
после гидролиза в течение 1 ч при 37 °С. Через 1 ч инкубации при
37 °С пробирки переносят на лёд для остановки гидролиза.
В каждую пробирку добавляют по 2 мл 0,6 М раствора HClO4 и
оставляют на 15 мин на льду. Центрифугируют 10 мин при
3000 об/мин. Надосадочную жидкость параллельных проб объединяют для определения содержания РНК и измеряют поглощение в ультрафиолетовом свете при 270 и 290 нм. Стенки пробирок тщательно
подсушивают, так как в осадке в дальнейшем определяют содержание ДНК.
Для расчёта РНК используют следующую формулу:
Количество РНК (мг/мл надосадочной жидкости) =
.
Подсушенные пробирки с осадками заливают 0,5 М раствором
HClO4 по 3 мл на пробу. Гидролиз проводят с каплеуловителем (во
избежание изменения объёма) на кипящей водяной бане в течение 20 мин.
92
Для расчёта ДНК используют формулу
Количество ДНК (мг/мл надосадочной жидкости) =
.
Белок в ткани определяют биуретовым методом. Для этого в три
пробирки помещают по 0,5 мл стандартных растворов с содержанием
альбумина 0,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают
0,5 мл гомогената.
В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива.
Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин (для развития окраски). Окрашенные
растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического
пути 5 мм, пользуясь зелёным светофильтром (длина волны 540 нм).
В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив.
Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс значения концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат –
соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую
плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют содержание белка в нём.
Соотношение РНК/белок и ДНК/белок оценивают в мкг/г. Делают вывод о биосинтетической функции различных тканей.
Контрольные вопросы
1. Что такое биосинтетическая функция ткани?
2. Каким образом она оценивается и для чего изучается?
3. Перечислите основные различия между ДНК и РНК.
4. Какие соотношения РНК и ДНК к белку считаются оптимальными для
живой клетки?
5. Особенности строения ДНК и РНК.
6. Транскрипция ДНК.
7. Трансляция ДНК.
8. Редупликация ДНК.
93
Лабораторная работа № 7
ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК
Цель работы – изучить состав нуклеиновых кислот дрожжевых
клеток.
Задачи работы – провести качественные реакции на пуриновые
основания, пентозную группировку и фосфорную кислоту нуклеиновых кислот, входящих в состав дрожжевых клеток.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Нуклеиновые кислоты – это важнейший компонент всех живых
организмов и всех живых клеток. С участием нуклеиновых кислот
происходит образование белков, являющихся материальной основой
жизненных процессов, каждый живой организм содержит свои специфические белки, которыми он отличается от других организмов.
Информация, определяющая особенности структуры белков, «записана» в ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и передаётся в ряду
поколений молекулами ДНК.
Нуклеиновые кислоты другого типа – рибонуклеиновые кислоты
(РНК) – являются обязательными и первостепенными участниками
самого механизма биосинтеза белков. В связи с этим организм содержит РНК особенно много в тех тканях, в которых интенсивно образуются белки. Активное участие РНК в биосинтезе белков определяет их значение в процессе морфогенеза, поскольку без интенсивного синтеза белков немыслимо появление любого органа.
Нуклеиновые кислоты являются полимерами мононуклеотидов.
Дезоксирибонуклеиновая кислота представляет собой полимер, состоящий из мономеров – дезоксирибонуклеозидмонофосфатов. Рибонуклеиновая кислота является полимером, состоящим из рибонуклеозидмонофосфатов. В живой клетке любого организма содержится три
вида рибонуклеиновой кислоты:
– рибосомальная РНК (р-РНК, 80 %);
94
– транспортная РНК (т-РНК, 15 %);
– информационная или матричная РНК (и-РНК, 5 %).
Нуклеиновые кислоты, подобно белкам, имеют первичную, вторичную и третичную структуры. Последовательность чередования
нуклеотидов в олигонуклеотидной цепи ДНК составляет её первичную структуру.
Выяснение вторичной структуры ДНК является одним из крупнейших открытий в биологии, поскольку при этом одновременно был
раскрыт механизм передачи наследственной информации в ряду поколений. В 1953 г. Д. Уотсон и Ф Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей.
Третичная структура ДНК эукариотических клеток также выражена в многократной суперспирализации молекулы, однако в отличие от
прокариот она осуществляется в форме комплексов ДНК с белками.
ДНК эукариот почти вся находится в хромосомах ядер, лишь небольшое количество её содержится митохондриях, а у растений и в пластидах. Суммарный материал хромосом – хроматин – содержит ДНК, гистоны, негистоновые белки и небольшое количество РНК. Гистоны являются простыми белками и составляют до 50 % хроматина.
В частицах вирусов, клетках бактерий, как и в ядрах высших организмов, ДНК плотно «упакована», образует сложные структуры.
Например, в хромосоме Е. coli содержится ДНК длиной более 1 мм,
хотя длина клетки не превышает 5 мкм. Одна из самых мелких молекул ДНК – вирусная, однако если её вытянуть, то она будет во много
раз длиннее, чем сам вирус [5].
Молекула РНК в отличие от ДНК состоит (за редким исключением) из одной полинуклеотидной цепи. Полинуклеотидная цепь РНК,
закручиваясь на себя, образует в палиндромных участках короткие
двухспиральные «шпильки», в которых азотистые основания образуют комплементарные пары: Г с Ц, А с У. Это довольно прочные
структуры, которые видны под электронным микроскопом.
95
Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные соединения, построенные из большого количества мононуклеотидов, соединённых друг с
другом фосфодиэфирной связью. Мононуклеотиды состоят из пуринового или пиримидинового основания, углеводного компонента (рибозы
или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. Нуклеиновые кислоты обладают кислотными свойствами вследствие диссоциации имеющихся
у них остатков фосфорной кислоты. Различные нуклеиновые кислоты
характеризуются входящими в их состав пуриновыми и пиримидиновыми основаниями и пентозами. Дезоксирибонуклеиновая кислота
(ДНК) представляет собой полимер, состоящий из мономеров – дезоксирибонуклеозидмонофосфатов. Рибонуклеиновая кислота является
полимером, состоящим из рибонуклеозидмонофосфатов.
Для изучения состава нуклеиновых кислот проводят кислотный
гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При продолжительном гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на мононуклеотиды, которые в свою очередь гидролизуются на пуриновые или
пиримидиновые основания, пентозу и фосфорную кислоту [5].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование
1. Дрожжи прессованные.
2. 10 %-ный раствор H2SO4.
3. Концентрированный 25 % NH3.
4. 1 %-ный раствор AgNO3.
5. Молибденовый реактив.
6. Концентрированная H2SO4.
7. 1 %-ный раствор тимола или α-нафтола.
8. Круглодонная колба с воздушным холодильником.
9. Воронка с фильтром.
10. Мерный цилиндр.
11. Штатив с пробиркой.
12. Электрическая плитка.
13. Глазные пипетки.
96
Ход работы
Кислотный гидролиз нуклеиновых кислот
1 г пекарских дрожжей помещают в круглодонную колбу
на 100 мл, добавляют 20 мл 10 %-ного раствора серной кислоты и
20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с воздушным холодильником, и содержимое кипятят под тягой в течение часа
(на асбестовой сетке и при слабом нагревании). Через час после начала кипения нагревание жидкости прекращают, дают ей остыть, переносят в цилиндр, доводят водой до первоначального объёма и фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеиновых кислот.
Серебряная проба на пуриновые основания
Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 1 %-ного раствора азотнокислого
серебра. Через 3–5 мин выпадает небольшой бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.
Качественная реакция Молиша на пентозную группировку
При взаимодействии концентрированной серной кислоты с гексозами или пентозами происходит их дегидратация: из пентоз образуется фурфурол, а из гексоз – оксиметилфурфурол. Они дают с тимолом
или α-нафтолом в присутствии серной кислоты продукты конденсации красного цвета. К 10 каплям профильтрованного гидролизата добавляют 2–3 капли 1 %-ного раствора тимола, перемешивают и по
стенке пробирки осторожно наслаивают 20 капель концентрированной серной кислоты. При встряхивании на дне пробирки образуется
красное окрашивание вследствие образования продукта конденсации
фурфурола с тимолом.
Молибденовая проба на фосфорную кислоту
К 3–5 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового
реактива и кипятят смесь несколько минут до изменения окрашивания. Жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении образуется жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорно-молибденовокислого аммония.
97
Контрольные вопросы
1. Что такое нуклеиновая кислота и как она построена?
2. Что такое ДНК и РНК? Назовите виды РНК.
3. Опишите качественные реакции на составные части нуклеиновых кислот.
4. Что представляют собой мононуклеотиды.
5. Как соединяются между собой мононуклеотиды в молекуле нуклеино-
вых кислот. Напишите формулу динуклеотида.
98
Лабораторная работа № 8
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК
ПО МЕТОДУ ТСУБОЛ И СТОУЭЛ
Цель работы – выделить ДНК и РНК из тканей печени животных.
Задачи работы – освоить навыки работы по выделению нуклеи-
новых кислот из клеток, оценить чистоту и нативность препаратов
ДНК и РНК из печени животных.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Структурными единицами нуклеиновых кислот являются азотистые, пуриновые и пиримидиновые основания, пентоза (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорная кислота. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований осуществляется клетками большинства тканей.
Пуриновое кольцо синтезируется из аминокислот (глицин, глутамин,
аспартат, производные тетрагидрофолата и СО2). Пиримидиновое
кольцо синтезируется из карбамоилфосфата и аспартата. Нуклеотидные коферменты FAD+, NAD+, NADP+, CoA, являющиеся производными адениловой кислоты, синтезируются из АТР и соответствующих витаминов, а именно рибофлавина, никотиновой кислоты и пантотеновой кислоты. Предшественники ДНК – дезоксирибонуклеотиды – образуются путём восстановления рибонуклеозиддифосфатов.
Конечными продуктами распада пуриновых оснований в процессе их
обмена в организме является мочевая кислота, аллантоин, аллантоиновая кислота, мочевина и глиоксиловая кислота, пиримидиновых
оснований – карбаминовая кислота и β-аланин. Природа конечного
азотосодержащего продукта, выводимого из организма, зависит
от вида организма.
Для изучения природы и свойств нуклеиновых кислот необходимо выделить их из ткани в нативном, по возможности неизменном
состоянии. Обычно этому препятствуют главным образом два обстоятельства: во-первых, крупные молекулы нуклеиновых кислот
99
упакованы в структуры и прочно связаны с другими химическими
компонентами клетки, в частности – с белками; во-вторых, в клетках
всегда есть активные нуклеазы, заключённые преимущественно в лизосомах и переходящие в свободное состояние при гомогенизации
тканей. Таким образом, при выделении нуклеиновых кислот особое
внимание необходимо уделять инактивации нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от сопутствующих примесей (белки, полисахариды, полифосфаты).
Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед
биохимическими и диагностическими процессами. Многие приложения, такие как амплификация, проведение обратной транскрипции,
детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР
в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез
ДНК и т.д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительной очистки нуклеиновых кислот.
При выборе метода необходимо учитывать приоритет предъявляемых к нему требований, таких как высокий выход нужной нуклеиновой кислоты, быстрота метода, большая пропускная способность или высокое качество продукта. Существуют различные методы, позволяющие выделять нуклеиновые кислоты из широкого спектра образцов, но лишь малое их число пригодно для автоматизации и
на многих стадиях выделения есть высокий риск контаминации. Присутствие загрязняющих веществ, например белков или карбогидратов, в таких комплексных смесях часто мешает реализовать необходимые реакции и методики.
Методы выделения нуклеиновых кислот можно разделить
по основным физическим и биохимическим признакам на следующие
классы:
– жидкофазные методы;
– твердофазные методы [5].
Жидкофазные методы
Классические методы выделения нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]