Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы:
1) лизис клеток (или разрушение физическим, механическим спо-
собом);
2) ферментативное разрушение белков протеиназами и/или про-
ведение депротеинизации клеточного лизата с помощью фенола
и хлороформа;
3) центрифугирование для удаления денатурированных белков
и фрагментов клеточных органелл.
Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или хаотропный агент гуанидин изотиоцианат. Если нет необходимости в длинных целых фрагментах
ДНК, клетки можно разрушить механическим способом путём перетирания со стеклом или речным песком в жидком азоте. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых силикатом SiO2. Некоторые коммерческие
наборы предусматривают 6 сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК
считается стандартным [5].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование
1. Буфер для гомогенизации (додецилсульфат натрия – 5 г, хло-
рид натрия – 0,877 г, цитрат натрия – 0,41 г, ЭДТА – 0,029 г).
2. Средняя луковица.
3. 95 %-ный этанол, выдержанный при – 20 °С.
111
4. Блендер/гомогенизатор.
5. 60 °С водяная баня.
6. Ёмкость со льдом.
7. Весы лабораторные.
8. Перчатки, нож, воронка, марля (4 слоя).
9. Цилиндр на 100 мл (для этанола).
10. Химический стакан на 250, 500 мл.
11. Химический стакан на 100 мл, стеклянная палочка.
12. Нож, доска.
Ход работы
Наденьте перчатки, порежьте луковицу среднего размера на кубики не более 3 см шириной. Перчатки предотвращают попадание
ферментов дезоксирибонуклеазы с рук в образец ДНК и не допускают
разрушение ДНК на маленькие фрагменты.
Взвесьте 50 г нарезанного кубиками лука. Перенесите весь взвешенный материал в стакан объёмом 500 мл.
Добавьте 100 мл буфера для гомогенизации к нарезанному кубиками луку и инкубируйте стакан на водяной бане в течение 15 мин
(не больше!). Эта термообработка смягчает ткань лука и делает возможным проникновение буфера для гомогенизации. Эта процедура
также денатурирует многие ферменты, которые могли бы помешать
процедуре выделения.
Быстро охладите образец до 15–20 °С в ледяной ёмкости (в смеси
льда и воды). Эту процедуру нужно проводить приблизительно 6 мин
для предотвращения денатурации ДНК.
Вылейте охлаждённый образец в стакан блендера или оставьте
в этом же стакане на 500 мл (если блендер без стакана) и закройте
блендер крышкой. Гомогенизируйте в течение 45 с на низкой скорости, затем 30 с на высокой скорости. Гомогенизация разрушает клеточную мембрану и освобождает содержимое клеток (углеводы, белки, жиры и нуклеиновые кислоты).
Вылейте гомогенат из блендера в стакан на 250 мл. Оставьте его
в ледяной ёмкости на 15–20 мин.
112
Пропустите гомогенат через четыре слоя марли в новый стакан
на 100 мл, следя за тем, чтобы пена осталась на марле.
Гомогенат должен содержать только ДНК и компоненты среды
для гомогенизации. Из компонентов, находящихся в гомогенате,
только ДНК не растворима в этаноле, выдержанном в морозильной
камере. Таким образом, когда этот «ледяной» этанол добавляется к
гомогенату, все компоненты гомогената растворяются, кроме ДНК.
Если работа выполнена верно, и молекулярная структура ДНК
осталась неповреждённой, генетический материал должен выпасть
в осадок как толстая волокнистая белая масса, которую можно намотать на стеклянную палочку или железную петлю.
Если же ДНК была повреждена, она также выпадает в осадок, но
как белая бесформенная масса, которая не может быть собрана на
стеклянную палочку.
Поместите свой стакан с отфильтрованным гомогенатом в ёмкость со льдом. Оставьте его охлаждаться, пока температура гомогената не достигнет 10–15 °С (приблизительно 10–15 мин).
Отмерьте 80 мл этанола (охлаждённого предварительно в морозилке при -20 °С) в мерный охлаждённый цилиндр на 100 мл. Медленно добавляйте этанол по краю стакана на 100 мл или мензурки,
пока белая волокнистая ДНК не выпадет в осадок.
Возможно, для проведения данной работы потребуется менее
80 мл спирта, чтобы осадить ДНК.
Попробуйте намотать волокнистую ДНК на стеклянную палочку,
вращая её в стакане только в одном направлении.
Полученную ДНК можно хранить в холодильнике для демонстрации качественного выделения ДНК.
Контрольные вопросы
1. Каковы основные принципы строения ДНК?
2. Что такое антипараллельность, комплементарность цепей ДНК?
3. Какие факторы вызывают денатурацию ДНК?
4. Опишите методику выделения ДНК из ткани лука.
5. Основные этапы выделения геномной ДНК.
113
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Концевая, И.И. Микробиология: культивирование и рост бактерий.
Практическое руководство для студ. биологич. спец. вузов / И.И. Концевая;
М-во образования РБ, Гомельский гос. ун-т им. Ф. Скорины. – Чернигов: Десна
Полиграф, 2017. – 44 с.
2. Василькин, В.М. Организация работы микробиологической лаборатории
/ В.М. Василькин, Ю.А. Боряева, Н.В. Василькин. – Саранск: Изд-во Мордов.
ун-та, 2017. – 56 с.
3. Биохимия: лабораторный практикум для студентов специальности
260501 «Технология продуктов общественного питания» / Авт.-сост.
А.В. Иванова, Т.Н. Клапанова. – Тольятти: Тольят. гос. ун-т, 2009. – 68 с.
4. Каюмов, А.Р. Практикум по молекулярной генетике: учебно-метод. пособие / А.Р. Каюмов, О.А. Гимадутдинов. – Казань: Казань: Казан. федер. ун-т,
2016. –36 с
5. Антонова, О.С. Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот
для проведения анализов в молекулярной биологии (обзор) / О.С. Антонова,
Н.А. Корнева, Ю.В. Белов, В.Е. Курочкин //Научное приборостроение. – 2010. –
Т. 20. – № 1. – С. 3–9.
114
СОДЕРЖАНИЕ
Введение ....................................................................................................................... 3
Правила работы в лаборатории молекулярной биотехнологии ............................. 5
Правила подготовки и оформление лабораторной работы ................................... 10
Порядок подготовки к выполнению лабораторной работы .................................. 10
Лабораторная работа № 1. Изучение основных приборов и сред,
используемых в молекулярной биотехнологии ..................................................... 12
Лабораторная работа № 2. Изучение строения и свойств основных
биологиеских систем, используемых в молекулярной биотехнологии ............... 30
Лабораторная работа № 3. Определение содержания белка в растительных
материалах .................................................................................................................. 43
Лабораторная работа № 4. Изучение ферментов клетки ...................................... 55
Лабораторная работа № 5. Изучение влияния температуры и рН
на активность ферментов клетки ............................................................................. 71
Лабораторная работа № 6. Оценка биосинтетической функции ткани
по соотношению РНК И ДНК к белку .................................................................... 82
Лабораторная работа № 7. Исследование состава нуклеиновых кислот
дрожжевых клеток ..................................................................................................... 94
Лабораторная работа № 8. Выделение ДНК И РНК по методу ТСУБОЛ и
СТОУЭЛ ..................................................................................................................... 99
Лабораторная работа № 9. Выделение геномной ДНК ....................................... 109
Библиографический список .................................................................................... 114
115
Учебное издание
ТЕМНИКОВА Ольга Евгеньевна
МАЛОЛЕТКОВА Яна Владимировна
Молекулярная биотехнология
Редактор Н.В. Беганова
Компьютерная верстка И.О. Миняева
Выпускающий редактор Ю.А. Петропольская
Подп. в печать 30.12.20
Формат 60×84 1/16. Бумага офсетная
Усл. п. л. 4,2. Уч.-изд. л. 4,1
Тираж 50 экз. Рег. № 240/20
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования
«Самарский государственный технический университет»
443100, г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Главный корпус
Отпечатано в типографии
Самарского государственного технического университета
443100, г. Самара, ул. Молодогвардейская, 244. Корпус № 8
116
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]