Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
сена и др. К числу сред неопределённого состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как
явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного
продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.
Синтетические среды – это среды определённого состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно
указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов.
Обязательными компонентами таких сред являются неорганические
соли и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т.д.
По назначению среды разделяют на основные, элективные
и дифференциально-диагностические.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания
многих бактерий. Например, триптические гидролизаты рыбных продуктов или казеина, мясных продуктов, из которых готовят жидкую
среду (питательный бульон) и плотную (питательный агар). К ним
относят и мясопептонный агар (МПА), который применяют для культивирования мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов, и солодовый агар (СА), который применяют для
культивирования дрожжей и плесневых грибов. Такие среды, как
правило, служат основой для приготовления более сложных питательных сред. В качестве основных иногда используют синтетические питательные среды, к которым добавляют аминокислоты, витамины, пептон, дрожжевой экстракт и т.д.
Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие
одного или целой физиологической группы микроорганизмов. На-
21
пример, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зелёный и т.д.). Для выделения стафилококков в среду может
быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой
концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды
применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий,
т.е. при получении накопительной культуры.
Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов,
для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и т.д. Принцип построения таких сред основан на различие
разных видов бактерий между собой по биохимической активности и
содержанию в них неодинакового набора ферментов, расщепляющих
субстраты, входящие в состав питательной среды.
В состав дифференциально-диагностической среды входят:
а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение
бактерий;
б) определённый химический субстрат, отношение к которому
является диагностическим признаком для данного микроорганизма;
в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельст-
вует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма.
Например, среда Левина, в качестве индикаторов содержащая эозин и метиленовый синий, изначально окрашена в чёрно-синий цвет.
Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные
в чёрный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие
этим свойством, бесцветны. Данная среда позволяет отличать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus. Для этой же цели на
практике часто используют среду Эндо.
По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими,
твёрдыми, сыпучими [1, 4].
22
Приготовление питательных сред
Жидкие питательные среды получают при растворении в воде
необходимого определённого набора питательных веществ, макро- и
микроэлементов. По своему составу они могут быть натуральными
и синтетическими.
Среды в твёрдом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твёрдых сред является то, что на них можно
выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции.
Приготовление твёрдых питательных сред достигается путём добавления к жидким средам определённых уплотнителей. Например,
агар, желатин, силикагель, каррагинан.
Наиболее распространённым из уплотнителей является агар – это
полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей и состоящий из двух полисахаридов – агарозы (70 %) и агаропектина.
Он обладает рядом полезных свойств, в частности:
1) способен образовывать в воде гели;
2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С;
3) не расщепляется под влиянием ферментов многих видов мик-
роорганизмов;
4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разру-
шаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару,
если смесь сразу же охладить;
5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности;
6) наиболее часто используемые концентрации 1,5–2,0 % являют-
ся относительно невысокими и их применение относительно экономично.
Желатин – белок, приготовленный из кожи и костей. «Уплотняющая» концентрация желатина – 17–20 %. Используется для специальных целей, поскольку образуемый им гель плавится при температурах около 30 °С. Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами многих микроорганизмов.
23
Силикагелем называют двуокись кремния (SiO2). Среды на осно-
ве силикагеля (1,5–2,0 %) используют для получения культур автотрофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерий в витаминах.
Каррагинан («растительный желатин») добывается путём экстракции из определённых видов красных морских водорослей. Каррагинан дешевле агара, используется в концентрации 2 % и не разрушается большинством видов бактерий. Однако приготовленные среды
следует разливать при высокой температуре – 55–60 °С.
Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой
(0,3–0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную конси-
стенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.
Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельчённого и увлажненного сырья (чаще всего растительного).
Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или водки), сельском хозяйстве (силосование кормов, выращивании грибов) и т.д.
Определение состава питательной среды предполагает, что при
этом будут учтены и такие биофизические факторы, как рН среды,
температура, подача и удаление молекулярного кислорода, являющиеся критическими для роста любой бактериальной культуры.
В бактериологической практике чаще всего используются сухие
питательные среды, которые получают в промышленных масштабах –
триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные
отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар.
Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и приготовлении, имеют относительно стандартный состав.
Стерилизация посуды и сред
Выращивание клеточных культур, используемых в биотехнологии и фундаментальных молекулярно-биологических исследовани-
24
ях, проводят в условиях полной асептики, т.е. стерильно. Особое
внимание следует обратить на чистоту посуды, предназначенной для
приготовления питательных сред и их компонентов; на подготовку
объектов к пересадке и культивированию.
Стерилизация – это уничтожение в материалах, продуктах, жидкостях, на поверхностях посуды и оборудования всех видов микроорганизмов и их спор.
Для этого посуду тщательно моют с использованием детергентов,
а стеклянную посуду еще иногда ополаскивают с раствором двухромовокислого калия в серной кислоте (хромовая смесь). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и
высушивают в сушильном шкафу.
Чтобы избежать заражения стерильной посуды из воздуха, перед
стерилизацией её закрывают ватными пробками, заворачивают
в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов и колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами.
1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20–
40 мин при температуре 100–130 °С. Продолжительность автоклави-
рования зависит от его режима: при давлении 0,5 атмосферы – 20–
40 мин, а при 1 атм – 15 мин.
2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стака-
ны, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу
при температуре 140 °С в течение 2 ч, при температуре 180 °С –
30 мин. При более высоких температур ах ватные пробки буреют,
а бумага становится ломкой.
Питательные среды
Успех культивирования объектов зависит от правильного выбора
питательной среды и тщательности её приготовления. В питательной
среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. Клеткам в больших количествах необходимы такие макроэлемен-
25
ты, как углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Помимо макроэлементов, клетки нуждаются также и в
некоторых микроэлементах (в незначительном количестве): натрий,
марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор,
ванадий и некоторые др. Снабжение клеток кислородом и водородом
осуществляется за счёт расщепления углеводов. Углерод является составной частью всех органических соединений, и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты.
Автоклавирование питательных сред для выращивания куль-
тур тканей проводят после их розлива в пробирки или колбы под давлением 0,7–0,8 атм при температуре 115–120 °С в течение 15–30 мин
в автоклавах. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации. Органические
жидкости, не выносящие нагревания (такие как антибиотики, глюкоза
и т.д.), освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор
0,45 мкм [3, 4].
Расчёт растворов
Растворы – это гомогенные системы, состоящие из двух или бо-
лее компонентов. Относительное содержание компонента в растворе
характеризуется его концентрацией. При этом преобладающий компонент, имеющий то же агрегатное состояние, что и раствор, обычно
называют растворителем, остальные компоненты – растворенными
веществами.
В зависимости от концентрации растворённого вещества различают растворы концентрированные и разбавленные; в зависимости от
природы растворителя выделяют водные и неводные растворы; по
уровню концентрации ионов Н+ и ОН– – кислые, нейтральные и ще-
лочные (основные). Способы выражения концентрации растворов
приведены в табл. 1.1.
26
Способы выражения концентрации растворов
Обозначение
Название и определение
m
Молярная весовая концентрация (моляльность) – число молей
растворенного вещества, приходящееся на 1000 г растворителя
CM
Молярная объёмная концентрация (молярность) – число молей
растворённого вещества, содержащееся в 1 л раствора
CN
Нормальность – число грамм-эквивалентов растворённого вещества, содержащееся в 1 л раствора
T
Титр – число граммов растворённого вещества, содержащееся в
1 мл раствора
P
Весовой процент (процентная концентрация) – число граммов
растворённого вещества, содержащееся в 100 г раствора
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Таблица 1.1
Материалы и оборудование
1. Триптон (казеин).
2. Дрожжевой экстракт.
3. NaCl.
4. NaOH.
5 Агар.
6. Колба Эрленмейера на 1000 мл.
7. Автоклав.
8. Маленькие чашки, ложечка для взвешивания.
9. рН-метр.
10. Чашки Петри (100 мм).
11. Стаканы 50, 100 см3.
12. Спиртовка, спички.
13. Металлическая петля.
Ход работы
В чистой колбе Эрленмейера приготовьте среду LB (Лурия –
Бертани). Для этого добавьте следующие компоненты к 400 мл Н2О:
27
– 5 г триптона;
– 2,5 г дрожжевого экстракта;
– 5 г NaCl.
Доведите до рН 7,5 с помощью NaOH (400 мкл 2,5 М NaOH).
Для приготовления твёрдой среды нужно добавить 7,5 г агара. Доведите объём до 0,5 л дистиллированной водой. Закройте колбу ватномарлевой пробкой, сверху пробку накройте фольгой.
Простерилизуйте среду в автоклаве.
После автоклавирования, охладите среду до 55 °С. Разлейте проавтоклавированную среду по чашкам прямо из колбы, наливая примерно 30–35 мл в стеклянную чашку Петри диаметром 100 м. Если
образуются пузырьки, то, не дожидаясь, пока застынет агар, следует
провести раскалённой иглой по поверхности пузырей.
Прежде чем использовать чашки с приготовленной средой,
их следует выдержать в течение 1 сут. при комнатной температуре,
для того чтобы не происходила конденсация паров воды, и крышки
не запотевали. Также готовые чашки можно упаковать в пластиковый
пакет и оставить на хранение в холодильнике при температуре 4 °С.
Перед использованием их необходимо выдержать закрытыми при
комнатной температуре для того, чтобы они полностью просохли в
течение 2 ч. Избыток влаги может привести к расплыванию колоний
бактерий и заражению их спорами грибов.
Контрольные вопросы
1. Какой порядок мытья посуды осуществляется в лаборатории молекуляр-
ной биотехнологии?
2. Перечислите основные способы стерилизации посуды, их особенности.
3. В чём заключается особенность приготовления питательных сред для
микроорганизмов?
4. Опишите методику приготовления среды Лурия – Бертани. Для каких
целей используется эта среда в молекулярной биотехнологии?
5. Опишите способы расчёта растворов, применяемых в молекулярной
биотехнологии.
28
6. Какое основное оборудование используют в микробиологической лабо-
ратории? Для каких целей?
7. Какая аппаратура используется для стерилизации?
8. Расскажите об устройстве автоклава.
9. Перечислите основные инструменты и посуду, применяемые в микро-
биологической лаборатории. Укажите их назначение.
10. Определите понятие «питательные среды».
11. Какие требования предъявляют к составу питательных сред?
12. Поясните на примерах классификацию питательных сред.
13. Какие вещества используются для получения твёрдых сред?
14. Почему агар является наиболее используемым уплотнителем при при-
готовлении плотных сред?
15. Перечислите наиболее распространенные питательные среды в бакте-
риологической практике, охарактеризуйте их.
29
Лабораторная работа № 2
ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ ОСНОВНЫХ
БИОЛОГИЕСКИХ СИСТЕМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ
В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
Цель работы – изучить строение и свойства отдельных колоний
S. cerevisiae, используемых в молекулярной биотехнологии в качестве
основных биологических систем.
Задачи работы – освоить навыки работы с металлической петлей, лабораторными микроорганизмами, научиться выделять изолированные колонии бактерий группы кишечной палочки и дрожжевых
клеток на чашках Петри.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Биологические системы, используемые в молекулярной биотехнологии
Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные
линии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организмы) исключительно важен для биотехнологического процесса.
Во многих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизводящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.
Все живые организмы принято делить на две основные группы:
прокариоты и эукариоты. Приблизительно 1,5 млрд лет назад про-
изошел переход от маленьких клеток со сравнительно простой внутренней структурой (так называемых прокариот, к которым относятся
различные бактерии) к большим по размеру и значительно более
сложно устроенным эукариотическим клеткам, подобным клеткам
высших животных и растений.
Основные структурные различия про- и эукариот:
– наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;
– строение и химический состав клеточной стенки;
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]