Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
спекты лекций и источники, указанные в списке литературы. В теоретическом введении к разделам практикума раскрываются основные
понятия молекулярной биотехнологии. Для успешного усвоения изучаемой темы студенты должны выполнить задания и ответить на вопросы, которые приведены в соответствующем разделе практикума.
Далее студент должен внимательно ознакомиться с методикой выполнения лабораторной работы, изложенной в практикуме, и заполнить пункты 1–4 протокола по прилагаемому образцу. Теоретические
вопросы по теме и особенности выполнения предстоящей работы обсуждаются преподавателем и студентами непосредственно на занятии
перед проведением работы. После обсуждения протокол (п. 4. Последовательность проводимых операций) может быть дополнен. Завершив подготовку, можно получить реактивы, лабораторную посуду
и приступить к самостоятельному выполнению работы.
Порядок оформления экспериментальных результатов
Результаты экспериментальных наблюдений и измерений при
проведении лабораторной работы заносят в протокол (пункт 5).
По полученным экспериментальным данным проводят необходимые
расчёты (пункт 6). Лабораторная работа считается выполненной
только после выводов, полученных по результатам работы (пункт 7).
Выводы должны содержать краткий анализ наблюдаемых изменений.
11
Лабораторная работа № 1
ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ ПРИБОРОВ И СРЕД,
ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
Цель работы – изучить основные приборы и среды, используе-
мые в молекулярной биотехнологии.
Задачи работы – освоить правила работы в лаборатории по молекулярной биотехнологии, изучить основные приборы и их характеристики, научиться приготовлению различных растворов и сред,
в том числе среды Лурия – Бертани для размножения бактериальных
штаммов.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Микроорганизмы повсеместно распространены в природе, что
является подтверждением их значимой роли в круговороте веществ
биосферы и в жизни человека. Со времен древности и до наших дней
человек использует деятельность микробов в ряде производственных процессов.
Микроорганизмы широко используются в пищевой промышленности в технологических процессах производства различных продуктов. На основе их жизнедеятельности основано производство кисломолочных продуктов, квашеных овощей, хлеба, вина и пива. Микроорганизмы используются в получении многих биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков.
Однако наряду с полезной микрофлорой существует и группа патогенных микробов − возбудителей болезней человека и животных.
Многие из них являются возбудителями порчи различных пищевых
продуктов.
Организация лаборатории молекулярной биотехнологии
Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного
типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок и реактивов. В лабораторной комнате
должно быть место для окраски микроскопических препаратов, где
12
должны храниться растворы красок, спирт, кислоты, фильтровальная
бумага и пр. Каждое рабочее место должно быть снабжено газовой
горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфицирующим раствором.
Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами и другими
лабораторными материалами.
Общее оборудование
Весы аналитические и лабораторные используются для взве-
шивания образцов проб, питательных сред, аналитических фильтров
(при бактериологическом анализе воздуха), реактивов. Весы желательно располагать на устойчивом основании или на специальном весовом столе.
Гомогенизаторы применяют для измельчения испытуемых проб
в различных объёмах. В пробирках, в том числе одноразовых, при работе с инфицированными образцами, в иных объёмах, с различными
типами роторов, гомогенизаторы лопаточного типа.
Для измерения рН приготовляемой питательной среды или непосредственно пробы используется рН-метр.
Автоклав применяют для стерилизации горячим паром под давлением при температуре не ниже +121 °С. Используется для уничтожения микроорганизмов, при стерилизации посуды инструментов,
в некоторых случаях для обеззараживания отходов. Это герметичный
котел с двойными металлическими стенками и крышкой. Пространство между стенками (водопаровая камера) заполняется водой. Внутренняя часть (стерилизационная камера) снабжена манометром, предохранительными клапанами и краном для спуска воды и пара. Для
создания герметичности автоклав плотно закрывается крышкой
с резиновой прокладкой. Применяют для стерилизации питательных
сред под давлением от 0,5 до 1,0 МПа в течение 20–30 мин.
Термостаты, которые бывают суховоздушными и водяными,
применяются для поддержания постоянства температуры при выращивании культур микроорганизмов. Оптимальная температура для
размножения многих микроорганизмов – 37 °С. Если температура ок-
13
ружающего воздуха выше, чем необходимо выдерживать в камере,
например летом, в жарком климате, то может понадобиться термостат с охлаждением. Аппарат необходим для выдерживания питательных сред, растворов с помощью некоторых методик выполнения
измерений (МВИ).
Холодильник необходим для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, реактивов, а также проб образцов в течение
оговоренного в нормативных документах срока. В некоторых случаях
для тех же целей может понадобиться морозильная камера, предназначенная для хранения при температуре не выше -18 °С.
Водяная баня применяется для поддержания заданной температуры в помещённых в резервуар бани лабораторных ёмкостей (колбы,
чашки, сосуды). Она необходима для обеспечения технологического
процесса при подготовке сред и суспензий.
Сушильный шкаф (печь Пастера) используют для стерилизации
сухим жаром посуды, инвентаря и сухих материалов, например крахмала, мела. Стерилизуемый материал предварительно заворачивают в
бумагу и помещают в шкаф так, чтобы он не касался стенок. Стерилизацию проводят при температуре 160 °С в течение 2 ч или при температуре 180 °С в течение 1 ч. Поднимать температуру выше 180 °С
не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться
(буреют, становятся ломкими). Простерилизованный материал вынимают после отключения и охлаждения шкафа. Лучше это сделать, когда температура в шкафу станет равна комнатной. Принципиальные
преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности; он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких веществ. К недостаткам
данного метода относятся медленная передача тепла и продолжительное время стерилизации; при использовании сухого жара более
высокие температуры (выше 170 °С) могут неблагоприятно действовать на некоторые металлы, а также вызывать обугливание и возгорание ватных пробок и бумаги. Кроме того, если нет циркуляции возду-
14
ха, может происходить образование слоёв воздуха с разными температурами. При обработке сухим жаром микроорганизмы погибают
в результате окисления внутриклеточных компонентов. Споры бактерий более устойчивы к сухому жару, чем вегетативные клетки.
Дистиллятор – устройство для получения дистиллированной
воды. Дистиллятор применяют для приготовления растворов, суспензий, разбавления реактивов.
Центрифуги необходимы для осаждения микроорганизмов
и других клеток, для разделения неоднородных жидкостей (эмульсии,
суспензии). В основе метода центрифугирования лежит принцип отделения крупных частиц с большей плотностью при низких скоростях. При повышении скорости центрифуг можно осадить все более
мелкие частицы
Микроскоп – прибор для исследования культур микроорганизмов, их морфологии. Требуется бинокулярный микроскоп с достаточно высоким увеличением. Идеальным для лаборатории молекулярной биотехнологии будет микроскоп с наличием конденсора темного поля фазово-контрастного устройства. Стереомикроскопы,
имеющие небольшое увеличение, в свою очередь будут удобны для
изучения колоний бактерий, их поведения в питательной среде. С помощью светового микроскопа изучают морфологию и строение клеток микроорганизмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию исследуемых организмов, ведут наблюдения за характером развития микробных ценозов (сообществ) в почве и других субстратах. С помощью электронного микроскопа исследуют субмикроскопическое строение клеток микроорганизмов, выявляют неизвестные ранее формы мельчайших микроорганизмов, ведут их учёт.
Вспомогательное оборудование и инструменты
В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрасы и чашки Петри.
В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и
на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют
15
обычно 1/3 пробирки, для анаэробных – 2/3. При выращивании микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды. Для культивирования аэробных микроорганизмов среду наливают
тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для
выращивания анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3.
Пробирки и колбы также используют для хранения питательных сред.
Чашки Петри применяют для выращивания культур микроорга-
низмов на плотных питательных средах. Они имеют высоту около
1,5 см и диаметр около 8–10 см (диаметр крышки несколько больше,
чем диаметр нижней чашки).
При помощи пипеток проводят пересев жидких культур микро-
организмов. Бродильные трубки используют для определения активности брожения по газообразованию.
Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические иглы, петли и шпатели. Их изготавливают из платиновой проволоки, которую закрепляют в специальных металлических
держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм, шпателя – 1,5 мм и более.
При посевах (и пересевах) культур микроорганизмов из колоний,
выросших на плотных средах, применяются иглы или шпатели. Шпатели также используют для взятия клеток микроорганизмов из колоний, врастающих в субстрат, и для размазывания жидких культур
на поверхности плотной питательной среды. Суспензии микроорганизмов берут петлей.
В связи с частой необходимостью точного дозирования проб
и реагентов при проведении лабораторных исследований механические
дозаторы являются неотъемлемой частью лаборатории. Дозаторы пе-
ременного объёма используются для дозирования жидкостей общим
объёмом от 0,1 мкл до 10 мл. Все механические дозаторы работают
по принципу воздушного замещения и используются со сменными на-
конечниками. При нажатии поршня в наконечнике возникает отрицательное давление (вакуум), определённый объём жидкости всасывает-
ся, вращение дозировального колесика изменяет высоту поршня, изме-
16
няя объём дозирования. Таким образом, в наконечник с высокой точностью набирается определённый объём нужного вещества.
Магнитная мешалка с подогревом предназначена для перемешивания жидкостей с помощью вращающегося в магнитном поле
якоря. Широко используется в лабораториях для обучающего процесса, проведения научных исследований, необходима для перемешивания образцов.
Самая распространённая посуда в лаборатории – пробирки. Они
есть в любой лаборатории. Ими пользуются биологи и микробиологи,
врачи и пищевики, химики. В пробирках смешивают малые объёмы веществ, в них помещают пробы. Все пробирки имеют цилиндрическую
форму. Дно у них бывает разное: плоское, круглое или коническое.
Колба Эрленмейера имеет коническую форму. У неё плоское дно
и цилиндрическое горлышко, иногда со шлифом. На боку её нанесены риски, по которым определяют объём содержимого. Изобрел эту
колбу немецкий химик Эмиль Эрленмейер в 1861 г. В конической
колбе удобно титровать, например, определять рН жидкости. В пластиковых колбах Эрленмейера при работе с микроорганизмами микробиологи приготовляют чистые культуры.
Мерная колба – это грушевидная стеклянная колба с длинной
горловиной, иногда со шлифом. Изобрел её французский технолог
Франсуа Декруазиль в 1809 г. Мерная колба имеет одну метку для
измерения объёма жидкости. У такой колбы широкое плоское основание, благодаря которому она устойчиво стоит без покачивания.
В мерных колбах приготовляют растворы заданной концентрации.
Посуда должна быть изготовлена из специального стекла, выдерживающего нагревание при высокой температуре, легко отмываться от загрязнений.
По назначению посуда может быть разделена на мерную, немерную и специального применения.
Мерная посуда имеет точную градуировку, её нельзя нагревать.
К ней относят:
– пипетки для отбора жидкости (объёмом 1, 2, 5 и 10 мл);
17
– бюретки (1–100 мл) для измерения точных объёмов;
– цилиндры (градуированы менее точно) и др.
К немерной, или посуде общего назначения, относят:
– пробирки (5–25 мл); стаканы (50–100 мл);
– колбы (100–1000 мл) плоскодонные, круглодонные, конические;
– воронки для переливания и фильтрования жидкости;
– стёкла предметные (белые стёкла с отшлифованными краями
размером 26 х 76 мм, толщиной 1,1–1,4 мм);
– стёкла покровные (квадратные стёкла размером 14 х 14 или 18 х
18, толщиной 0,15–0,17 мм);
– чашки Петри. Стекло должно быть тонким, прозрачным, без пузырьков воздуха;
– трубки стеклянные и резиновые, ступки фарфоровые и др.
К посуде микробиологической специального назначения относят:
– иглы микробиологические;
– петли микробиологические;
– колбочки Пастера (для сохранения культур микроорганизмов);
– склянки из белого и коричневого стекла разных объёмов;
– склянки из жаростойкого стекла (для хранения питательных
сред и выращивания культур);
– фарфоровые банки с крышками для отработанных препаратов;
– эксикаторы;
– шпатели и др.
Новую посуду промывают подкисленной (1–2 % НСl) водой, так
как при нагревании новое стекло выделяет много щёлочи и может
изменить реакцию питательной среды [1, 3].
Требования к составу питательной среды
Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма.
В широком смысле слова питательная среда должна соответст-
вовать следующим требованиям.
Во-первых, питательная среда должна включать доступный для
клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким
18
источником служит свет, для других – органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат.
Во-вторых, среда должна содержать все необходимые компонен-
ты для биосинтетических процессов в клетке. Причём синтетические
способности микроорганизмов могут варьировать от использования
углекислого газа в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода – кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы).
В узком смысле слова любая искусственная питательная среда
должна соответствовать следующим требованиям:
– содержать все необходимые для роста питательные вещества
в легкоусвояемой форме;
– иметь оптимальную влажность, вязкость, рН;
– быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной ёмкостью и, по возможности, прозрачной.
Питательной средой в микробиологии называют среды, которые
содержат различные соединения простого или сложного состава,
применяемые для размножения микроорганизмов в промышленных
или же лабораторных условиях. Ещё в 1930 г. их было классифицировано около двух тысяч, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определённых общих принципах. Для размножения
любых видов бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты.
Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие
неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимили-
руют СО2 и получают энергию путём окисления нитритов в нитраты.
Гетеротрофные бактерии используют органические соединения
в двух целях:
1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество
окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО2, органических кислот и др.;
19
2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с об-
разованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях,
требующих затрат энергии. Так, E. coli способна к росту на простой
среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и
др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно.
Такие соединения называются факторами роста.
Классификация питательных сред
Выбор питательной среды в значительной степени зависит от целей
проводимого исследования, а существующая классификация питательных сред учитывает характеристику их следующих особенностей.
По составу питательные среды делятся на натуральные и синте-
тические.
Натуральными называют среды, которые обычно состоят
из продуктов растительного или животного происхождения, имеют
сложный и неопределённый химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой
смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих),
образующихся при их гидролизе. Кислотный (НСl) гидролиз белков
используется для приготовления полных гидролизатов. Действие
ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит к неполному гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как
правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут
лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе,
вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие
микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты – нет.
К питательным средам неопределённого состава можно отнести
и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный
агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]