Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
лизис биологического материала детергентами или хаотропными
агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются
органические растворители, такие как фенол и/или хлороформ или
этанол. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть
достигнуто добавлением перхлората натрия. Для отделения РНК
от ДНК необходимо селективное инкубирование с хлоридом лития
или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом
или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Такие методы увеличивают вероятность деградации нуклеиновых кислот, потери образца или
кросс-контаминации образцов, если несколько проб обрабатываются
одновременно. При выделении РНК очень велик риск контаминации
со стороны присутствующей в исходном образце ДНК.
Стандартная методика получения чистого препарата основана
на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется
в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНК используется фенол-хлороформная экстракция. При перемешивании
клеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится
в верхней (водной) фазе, а денатурированные белки – в нижней (органической) фазе. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые
нельзя автоматизировать.
Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно
Известны методы, согласно которым можно выделить одновременно и ДНК, и РНК из одного источника. Большинство известных
методов является модификацией оригинальной процедуры, разработанной сотрудниками компании Chirgwin и соавторами.
При этом используются сильные хаотропные агенты, такие как
гуанидин тиоцианат и цезия трифлуороацетат для одновременного раз-
рушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). Лимитирующими факторами таких методик являются
необходимость ультрацентрифугирования и большое время анализа.
101
Методы одновременного выделения ДНК и РНК, в которых
не присутствует операция центрифугирования, имеют преимущество
ещё и потому, что фенол действует как эффективный депротеинизирующий агент, разрушающий клетки и денатурирующий белки. Для
эффективного отделения высокомолекулярной ДНК от РНК сначала
производится фенольная экстракция, а затем две фенол-хлороформные
экстракции для одновременного удаления белков и липидов из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты. С целью повышения выхода
нуклеиновых кислот оптимизированы компоненты экстрагирующего
буфера. Например, определённый рН буфера (pH 7.9) в присутствии детергента (0,2 % додецилсульфат натрия) и относительно низкая концентрация соли (100 мМ LiCl) позволяют эффективно разделять нуклеиновые кислоты в водной фазе и диссоциировать белки. Кроме того, 10 мМ
ЭДТА не позволяет образовываться белковым комплексам и образует
хелатный комплекс с Mg2+, ингибируя, таким образом, действие магний-зависимых нуклеаз.
В методе, предложенном авторами из Krieg и соавторами, для отделения высокомолекулярной ДНК достаточно лизиса и процедуры
экстракции с использованием последующей этанольной преципитации. Время, необходимое для выделения валовых клеточных РНК
и ДНК, составляет примерно 2 ч [5].
Твердофазные методы
В твердофазных методах выделения нуклеиновых кислот используются следующие процессы и принципы:
а) водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей, обычно кварцем, в хаотропных условиях;
б) ионообмен в водном растворе, обычно с использованием анионообменников;
в) аффинность;
г) механизмы исключения по размеру.
Твердофазные системы, адсорбирующие нуклеиновые кислоты, –
это частицы на основе кварца, стеклянные волокна, анионообменные
носители, которые используются в хроматографических сепарацион-
102
ных колонках. Эти носители применяются для выделения или очистки нуклеиновых кислот с высококонцентрированными растворами
хаотропных солей (йодид натрия, перхлорат натрия, гуанидин тиоцианата). Описано применение диатомовой земли в качестве сорбента, в этом случае связывание также происходит в присутствии хаотропной соли. Другие методы основаны на совместной детергенции с
материалами, связывающими нуклеиновые кислоты, или на использовании твёрдого сорбента со связывающими нуклеиновые кислоты
функциональными группами в сочетании с полиэтиленгликанами и
солями в высокой концентрации.
Известна группа методов подготовки проб, основанная на использовании ионообменников типа Chelex, сорбирующих примеси,
мешающие ПЦР. Однако эти методы в большинстве случаев не могут
удалить все возможные примеси, поэтому их применение довольно
ограничено.
Метод выделения нуклеиновых кислот на стекле
Крайне удобным является метод выделения нуклеиновых кислот,
предложенный авторами фирмы Boom с соавторами. Этот метод
включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом,
который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, и последующую сорбцию нуклеиновой кислоты на
носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко»
и т.д.). Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата). В таких условиях связывания
белков с матрицей не происходит. Хаотропные соединения представляют собой вещества, нарушающие упорядоченную структуру воды и
тем самым приводящие мембраны в состояние хаоса (например, мочевина, йодид натрия). Таким образом, помимо связывания, хаотропные агенты обеспечивают разрушение клеточных мембран и лизис
клеток с последующим выходом нуклеиновой кислоты. Примеси отмываются хаотропной солью, а хаотропная соль – 80 %-ным этанолом. Очищенная нуклеиновая кислота снимается со стекла буфером
103
с низкой ионной силой. В настоящее время многие коммерческие
фирмы предлагают для выделения нуклеиновых кислот колонки со
стеклянной матрицей (например, Zymo Research и Promega). Методы,
эксплуатирующие эти колонки, включают стадии центрифугирования
или вакуумирования, однако для их применения необходимо около 15 мин [5].
Метод на основе магнитной сепарации
Использование магнитных твёрдых носителей в биохимических
и молекулярно-биологических процессах имеет много преимуществ
по сравнению с немагнитными сепарационными методами. Обычно
магнит прикладывается к стенке сосуда, содержащего образец, чтобы
частицы агрегировали у стенки сосуда, а остаток образца можно было
убрать. Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР-реакцию, например полисахариды, фенольные компоненты, гумус.
Для процесса выделения используются магнитные носители
с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные
из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой
кислоте. Магнитные носители имеются в продаже или могут быть изготовлены в лаборатории. Магнитные частицы производятся из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла
или на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью. Особенно подходят
для выделения суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют друг с другом в отсутствие магнитного поля. Эти частицы
приобретают магнитный момент в сильном магнитном поле, но
не сохраняют постоянного магнетизма, когда поле убирают. Если
устранены магнитная агрегация и слипание частиц, то в течение реакции достигается суспензирование частиц и единообразная экстракция нуклеиновых кислот.
Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием. Нуклеиновая
кислота связывается со стеклянной поверхностью, затем связанная
104
с частицами она проходит те же стадии экстракционного процесса,
что и в методике Boom: после серии отмывок в пробе остается нуклеиновая кислота, сорбированная на носителе, с которого она легко
снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипетирующих рабочих
станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими
количествами ДНК в образце.
Валовые ДНК и РНК выделяются с помощью одних и тех же
магнитных частиц. Чтобы отделить РНК от ДНК, РНК уничтожается
до стадии сепарации ДНК. Наилучшим вариантом является добавление РНКазы или щёлочи. Наоборот, РНК может быть выделена при
разрушении ДНК дезоксирибонуклеазой (ДНКазой).
Например, первичный метод очистки плазмиды – отделение
плазмидной ДНК (пДНК) от хромосомной ДНК и клеточной РНК
бактерии хозяина. Сотрудниками Stadler с соавторами показали, что
даже в случае многокопийной плазмиды пДНК составляет не более
3 % клеточного лизата и большинство контаминантов заряжены отрицательно (РНК, комплементарная ДНК (кДНК), эндотоксин), сходны по размеру (кДНК, эндотоксин) и по гидрофобности (эндотоксин).
Были разработаны методы для наработки очищенного лизата, но они
не способны убрать белки и липиды. Также возможен щелочной лизис бактериальных клеток с последующей нейтрализацией. Протоколы очистки лизатов отличаются друг от друга концентрациями солей,
объёмами, рН, температурой, продолжительностью стадий. Эти методы эксплуатируют разницу в характеристиках ковалентной закрытой кольцевой пДНК и фрагментов хромосомной ДНК при денатурации и ренатурации. Например, суперпарамагнитные частицы, модифицированные мультивалентным катионным полиэтиленимином, используются для выделения пДНК из очищенного бактериального лизата.
105
Доступны различные магнитные частицы с оптимизированными
буферами и протоколами для лабораторий и автоматических систем.
Обычно к магнитным носителям прилагаются связывающие растворы, с помощью которых осуществляется селективное связывание
нуклеиновых кислот. Например, для связывания вирусных нуклеиновых кислот можно использовать как вирусные белки, так и комплементарные ДНК- или РНК-последовательности.
Метод выделения основан на гибридизации последовательности
олигодеокситимидина стабильным полиаденилированным 3-концом
эукариотической мРНК. Длина комплементарной последовательности –
20–30 олигонуклеотидов. Эта последовательность либо напрямую ковалентно связывается с поверхностью частицы, либо не напрямую,
через биотинилированные олигонуклеотиды, и с помощью взаимодействия между покрытыми стрептавидином частицами. Методы количественного определения нуклеиновых кислот, основанные
на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения анализа.
Необходимым этапом различных методов спектрофотометрического
определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряжённая с гидролизом полинуклеотидов.
В связи с этим нужно иметь в виду, что из исследуемого материала
предварительно необходимо удалить свободные нуклеотиды.
В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного
А.С. Спириным, лежит экстракция их горячей хлорной кислотой из
биологического материала с последующим определением поглощения
экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм [5].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование
1. Ткани печени животных.
2. 0,14 М раствор NaCl.
3. Этиловый спирт.
4. Кварцевый песок.
106
5. Ледяная баня.
6. Ступка с пестиком.
7. 10 %-ный NaCl.
8. Хлороформ.
9. Насыщенный раствор NaCl.
10. Раствор хлорной кислоты.
11. Пипетки вместимостью 10, 25 мл.
12. Центрифуга, центрифужные пробирки.
13. Штатив с пробирками.
14. УФ-спектрофотометр, кюветы.
15. Электрическая плитка.
Ход работы
Ткань печени растирают в холодном состоянии с кварцевым песком, затем добавляют 4 объёма 0,14 М хлористого натрия. Гомогенат
центрифугируют в течение 15 мин при 300 об/мин. Полученный осадок содержит все количество ДНК, присутствующие в данном количестве ткани печени, надосадочная жидкость содержит наибольшую
часть РНК.
Выделение ДНК
Осадок подвергают механическому растиранию и 2–3-кратной
вытяжке в холодном состоянии насыщенным раствором NaCl. Экстракт центрифугируют, а белковый осадок удаляют. К надосадочной
жидкости добавляют 2 объёма этилового спирта, образовавшийся волокнистый осадок ДНК очищают промыванием и взбалтыванием
с хлороформом.
Выделение РНК
Надосадочную жидкость исходного гомогената экстрагируют при
нагревании 10 %-ным раствором NaCl, добавляемого в равном объёме. Затем экстракт просветляют фильтрованием. К просветлённому
экстракту добавляют двойной объём этилового спирта. Образуется
осадок РНК, который очищают встряхиванием с хлороформом.
Оценка чистоты и нативности выделенных препаратов ДНК и РНК.
107
Добавляют в каждую пробу по 1,5 мл раствора хлорной кислоты,
закрывают пробирки капельницами и ставят на гидролиз в кипящую
водяную баню на 20 мин. Гидролизаты охлаждают, определяют экстинкцию содержимого каждой пробы на спектрофотометре в кювете
с толщиной слоя 1 см при 270 и 290 нм.
Содержание ДНК рассчитываются по формуле
Количество ДНК (мг/мл) =
.
Для расчёта содержания РНК используют формулу
Количество РНК (мг/мл)=
,
где D
270 нм; D
– оптическая плотность исследуемого гидролизата при
270
– оптическая плотность исследуемого гидролизата при
290
290 нм; 0,19 – удельная оптическая плотность фосфора нуклеиновых
кислот в концентрации 1 мг/мл; 10,1 и 10,5 – коэффициенты пересчёта содержания фосфора на концентрацию нуклеиновых кислот, исходя из теоретического содержания фосфора в ДНК 9,9 % и
в РНК 9,5 %.
Контрольные вопросы
1. Каков принцип выделения из ткани ДНК и её обнаружения?
2. Каковы биологические функции нуклеотидов и полинуклеотидов?
3. Каково строение нуклеотидов и полинуклеотидов?
4. В чём состоит биосинтез пуриновых и пиримилиновых оснований?
5. Классификация методов выделения ДНК И РНК.
6. Особенности жидкофазных методов.
7. Особенности и принципы твердофазных методов.
108
Лабораторная работа № 9
ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК
Цель работы – получение препарата геномной ДНК из тканей
лука.
Задачи работы – знакомство с физическими свойствами геномной ДНК, очищенной из растительного материала, освоение методики выделения и очистки ДНК из растительного материала.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
В 1953 г Дж. Уотсон и Ф. Крик выдвинули гипотезу о строении
ДНК. Согласно их модели, так называемая В-формула ДНК (основная
форма ДНК, в которой большая часть её молекул существует в клетке) представляет собой правильную спираль. Эта спираль образована
двумя полинуклеотидными цепями, закрученными друг относительно
друга и вокруг общей оси.
При этом углеводно-фосфатная цепь располагается снаружи, а
азотистые основания – внутри спирали. Пуриновые и пирмидиновые
основания, принадлежащие разным цепочкам, соединяются водородными связями, образуя специфические пары. Так, аденин связывается
с тимином, а гуанин – с цитозином. Диаметр спирали постоянен
вдоль всей молекулы ДНК. Такая регулярность спирали возможна
только в том случае, если аденин образует стабилизированную водородными связями пару с тимином, а гуанин – с цитозином. Обе пары
близки по форме и имеют одинаковые размеры. Они связаны осью
симметрии второго порядка, но при этом псевдосимметричны: при
повороте на 180° вокруг оси, лежащей в плоскости рисунка (с выходом оснований из его плоскости), совпадают только Cl-атомы.
Комплементарные основания в двойной спирали ДНК лежат
в одной плоскости, причём эта плоскость практически перпендикулярна главной оси спирали. Спираль правозакрученная, а полинуклеотидные цепи в ней антипараллельны. Это означает, что если двигаться вдоль оси спирали от одного её конца к другому, в одной цепи
109
будут встречаться фосфодиэфирные связи в направлении 3′→5′,
а в другой – в направлении 5′→3′. Иными словами, на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположены 5′-конец одной и 3′-конец
другой цепи.
Специфическая вторичная структура ДНК определяется двумя
типами взаимодействия между гетероциклическими основаниями
нуклеотидных остатков:
1) взаимодействиями между основаниями в комплементарных
парах;
2) межполостными взаимодействиями оснований, расположенных
друг над другом, или так называемыми стэкинг-взаимодействиями.
Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным (основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. При наличии выделенной ДНК, далее становятся
возможными её амплификация (с помощью полимеразной цепной реакции – ПЦР), определение последовательности (секвенирование),
рестрикционный анализ, клонирование, гибридизация.
Все живые организмы делятся на про- и эукариот. В клетках бактерий, как правило, существует одна кольцевая хромосома размером
от 0.4 до нескольких десятков миллионов пар оснований, упаковка
которой достигается за счёт суперскрученности. Дополнительно к ней
в бактериях встречаются небольшие кольцевые молекулы ДНК –
плазмиды. Количество их копий может варьировать от 1 (низкокопийные) до нескольких тысяч (мультикопийные) на клетку. У эукариот геном представлен несколькими линейными молекулами ДНК,
которые упаковываются с помощью гистоновых белков.
В общем случае для выделения ДНК клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а ДНК очистить от других клеточных
компонентов. В случае эукариот нужно отделить ДНК от белков,
входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При
этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить её целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК
при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются.
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]