Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
– наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических органелл.
В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК
находится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной
клеточной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических
органелл. В оптимальных условиях прокариотическая клетка может
делиться каждые 20 мин и таким образом давать жизнь более 10 млрд
клеток менее чем за сутки. В эукариотической клетке имеется ядро,
отделённое от цитоплазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК
находится в ядре.
В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеллы:
мембраны, окружающие ядро; митохондрии, образующие лабиринт
эндоплазматического ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и
мембранные белки. Мембраны формируют стопки уплощённых пузырьков, составляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (субклеточные структуры диаметром 0,20–
0,5 мкм), содержащие гидролитические ферменты, необходимые для
внутриклеточного пищеварения. Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов белки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие
окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные
высокореакционноспособные перекиси (пероксиды).
Обмен между внутриклеточными, окружёнными мембранами
структурами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.
Различают две группы бактерий – эубактерии, населяющие
почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся
в таких средах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники.
Исходя из температурного режима, который предпочитают те или
иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до
90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47 °С) и психрофилы, психротрофы (от -5 до 35 °С).
31
Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определённом диапазоне температур, – полезный инструмент для решения различных биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником генов, кодирующих термостабильные ферменты, а
генетически видоизмененные психротрофы используются при пониженной температуре для биодеградации токсичных отходов, содержащихся в почве и воде.
Среди множества биологических объектов, использующихся
в биотехнологии, основными «рабочими лошадками» являются бактерии
Escherichia соli, одноклеточные дрожжи Saccharomyces cerevisiae и раз-
личные клеточные линии животного происхождения. Все они играют
важную роль в получении белков, кодируемых клонированными генами.
Escherichia соli – грамотрицательная непатогенная подвижная
палочка длиной менее 1 мкм. Традиционная среда её обитания – кишечник человека, она может также высеваться из почвы и воды.
Штаммы Е. соli культивируются на обогащённых жидких питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. Е. соli можно культивировать в аэробных
и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е. соli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточной массы и продукция белка
лимитируются содержанием в питательной среде растворенного кислорода, для этого в ферментерах создают условия аэрации. Кроме
Е. соli в МБТ используют множество других микроорганизмов, кото-
рые подразделяют на две группы:
1) микроорганизмы как источники специфических генов (например,
ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется
в широко применяемой полимеразной цепной реакции (ПЦР); этот ген
был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е. соli);
2) микроорганизмы, созданные генно-инженерными методами
для решения определённых задач (например, различные штаммы
Corynebacterium glutamicum, генетически модифицированные с целью
повышения продукции промышленно важных аминокислот).
32
Saccharomyces cerevisiae – непатогенные одноклеточные организмы диаметром клетки около 5 мкм. Во многих отношениях представляют эукариотический аналог Е. соli и S. cerevisiae, размножаются почкованием. Их способность к превращению сахара в этанол и
углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и
хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5–2 ч. S. cerevisiae является
удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе человека, так как многие гены, ответственные за регуляцию клеточного
деления S. cerevisiae, сxoдны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих
за развитие новообразований. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК
человека.
Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок
часто подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для
правильного функционирования белка. Однако Е. соli и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для
получения полноценных эукариотических белков используют
S. cerevisiae и другие виды дрожжей.
В качестве биологических систем в МБТ используют культуру
эукариотических клеток. Кусочек ткани определённого организма
(насекомого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного материала; при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся
клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты,
антибиотики, витамины, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз
в сутки) на стенке ёмкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не перенести клетки в ёмкости со свежей питательной средой, рост прекращается. Обычно удаётся переносить
(перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50–100 клеточ-
33
ных генераций исходной (первичной) клеточной культуры, затем
клетки начинают терять способность к делению и гибнут.
Понятие о культивировании микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной
среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температуры, кислотности, аэрации, света и т.д.). При этом количественные
показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий.
Можно выделить методы культивирования на твёрдых и в жидких питательных средах; в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Характеристики этого процесса устанавливают путём
измерения таких показателей, как число клеток или их биомасса.
В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрасы и чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно
стерилизуют различными методами.
Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посе-
вом, или инокуляцией.
Посев микроорганизмов требует соблюдения определённых правил, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами. Перед посевом следует сделать надписи на посуде. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращивали
на плотной среде. В случае когда микроорганизмы выращены в жидкой среде, лучше пользоваться пипеткой.
После пересева пробирки или другие сосуды с микроорганизмами помещают в термостаты с определённой температурой.
По окончании работы посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть. Допускается заливать дезинфицирующим раствором поверхность плотных сред. Через сутки среды можно
выбрасывать и посуду мыть. Неаккуратное обращение с культурами
микроорганизмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля.
34
Способы культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят сле-
дующим образом:
– на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред,
когда микроорганизмы получают кислород прямо из воздуха;
– в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае
микроорганизмы используют растворённый в среде кислород. В связи
с низкой растворимостью кислорода для обеспечения роста аэробных
бактерий в толще среды требуется постоянное аэрирование.
Наиболее простой и широко используемый в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на шейкерах, обеспечивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью
100–200 об/мин и более. В работе удобно использовать термостатшейкер. Помимо перемешивания, аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды стерильного воздуха.
Культивирование анаэробных микроорганизмов. Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают
бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не
растут на поверхности твердой или полужидкой среды на воздухе при
атмосферном давлении.
Аэротолерантные бактерии хорошо растут на поверхности агара
и чашках при низком уровне кислорода. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному потенциалу (редокс, Eh)
среды. При увеличении Eh выше 100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для удаления кислорода и создания соответствующих условий
среды можно воспользоваться следующими методами.
1. Культивирование в микроанаэростате – аппарате для выращи-
вания микроорганизмов, в котором воздух замещён газовой смесью.
35
Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот
с 5 % СО2 и 10 % Н2.
2. Использование химических веществ, поглощающих молеку-
лярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода
в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола,
дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. Поглотители помещают
на дно химического эксикатора, имеющего притёртую крышку, а
также вносят анаэробные бактерии, засеянные в колбу, пробирку или
чашку Петри. При таком способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объём
замкнутого пространства, в котором выращиваются бактерии.
3. Использование восстанавливающих агентов, которые добавля-
ют для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолят натрия, цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота. Удаления кислорода из среды можно добиться и в результате быстрого нагревания и кипячения среды с последующим быстрым охлаждением. Если в такую среду засеять анаэробные микроорганизмы
и наслоить смесь (1:1) масла и парафина, то в подобных условиях будет наблюдаться рост нестрогих анаэробов.
4. Выращивание совместно с аэробными или факультативно
анаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими
агентами перед инокуляцией анаэроба проводят культивирование,
например, E. coli, что приводит к удалению из среды остаточного
кислорода. Перед инокуляцией анаэробов клетки E. coli убивают
нагреванием.
Существует и другая модификация метода. На половине чашки
Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой –
анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется после полного использования кислорода аэробом.
Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие
методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:
– выращивание в высоком слое среды;
36
– выращивание в толще плотной среды;
– культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в среду уменьшается с увеличением её плотности;
– заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина;
– культивирование с помощью СО2-инкубатора – самый современный и эффективный метод работы с анаэробными бактериями –
выполнять работу по получению первичной и перевиваемых культур,
их культивированию для накопления биомассы, с использованием
анаэробной рабочей станции [1].
Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные
среды
Посев микроорганизмов обычно осуществляется бактериологической петлей.
Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом.
В правую руку берут петлю и стерилизуют её нагреванием в пламени
спиртовки. Пробирку с культурой берут в левую руку таким образом,
чтобы поверхность питательной среды с выросшими колониями микроорганизмов была хорошо видна. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружный конец ватной пробки к ладони и вынимают пробку из пробирки. Края
открытой пробирки слегка обжигают в пламени горелки, вводят
в пробирку стерильную петлю. Петлю охлаждают прикосновением
к внутренней поверхности стекла пробирки или на свободной от микроорганизмов части среды и после этого захватывают небольшое количество микробной биомассы. Осторожно вынимают петлю из пробирки, горлышко пробирки вновь обжигают, ватную пробку проводят
над пламенем спиртовки и закрывают ею пробирку. Пробирку с культурой помещают в штатив, а извлеченную культуру переносят в жидкую питательную среду, находящуюся в другой пробирке или колбе.
Оставшиеся на петле после пересева клетки микроорганизмов
тщательно сжигают в пламени спиртовки. В этом случае прокаливание петли начинают с участка проволоки, ближе к основанию держа-
37
теля, чтобы клетки, оставшиеся на петле, подсохли и не образовали
аэрозоль, загрязняющий воздух. Затем петлю переводят в вертикальное положение, прокаливают докрасна и только после этого ставят
на место.
Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной средой
почти до дна. Слегка прикасаясь петлей к поверхности среды, проводят от дна вверх зигзагообразную или прямую черту-штрих.
Посев на поверхность агаризованной среды в чашках Петри можно производить с помощью бактериологической петли, микробиологического шпателя или методом реплик.
При посеве петлей отбирают клетки микроорганизмов с агаризованной или жидкой средой, приоткрывают крышку чашки Петри
и на поверхности среды проводят штрихи, после чего чашку закрывают и помещают в термостат крышкой вниз.
При посеве микроорганизмов из жидкой среды с использованием
микробиологического шпателя поступают следующим образом. Для
этого вынимают из бумаги пипетку за верхний конец, насаживают
на него резиновую грушу. На поверхность среды в чашке наносят
с помощью стерильной пипетки заданный объём жидкой культуры.
Одновременно вращая чашку и проводя круговые движения стерильным шпателем, суспензию распределяют по поверхности среды. После
использования пипетку немедленно переносят в дезинфицирующий
раствор (хлорамина, фенола), не касаясь ею окружающих предметов.
При пересеве микроорганизмов методом реплик используют стерильные кусочки бархата с коротким жёстким и густым ворсом. Бархат помещают на специальный столик для реплик, диаметр которого
меньше диаметра чашки Петри, и закрепляют металлическим кольцом. Чашки Петри с агаризованной питательной средой и сформировавшимися колониями микроорганизмов накладывают на бархат той
стороной, на которой находится питательная среда, и слегка прижи-
38
мают. Чашку осторожно снимают, а бархат с отпечатками колоний
после этого может служить исходным штампом для засева других
чашек со средой. Возможно снятие отпечатков на серию чашек, содержащих различные среды. В качестве контроля в последнюю очередь производится отпечаток на чашку Петри с исходной питательной средой.
При глубинном посеве микроорганизмов в агаризованную питательную среду её предварительно разливают по 15–20 мл в пробирки и
стерилизуют. После охлаждения расплавленной среды до 48–50 °С
в каждую пробирку стерильной пипеткой вносят по 0,1–1,0 мл жидкой
культуры микроорганизмов. При необходимости готовят серию разведений культуры микроорганизмов с таким расчётом, чтобы при высеве
получить изолированные колонии. Содержимое пробирки перемешивают путём её вращения между ладонями и быстро выливают в чашку
Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат.
В некоторых особых случаях используют выращивание бактерий
в полужидких средах. Такая среда пригодна для культивирования микроаэрофильных бактерий, изучения подвижности клеток и хемотаксиса.
При использовании 0,1–0,4 % агара гелеобразующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны
смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путём для проникновения кислорода в более глубокие слои
в данном случае является диффузия, что создаёт градиент концентрации кислорода. При инокуляции среды в пробирке уколом петлей микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Анаэробы начинают
расти в нижней части полужидкой среды.
Все описанные выше манипуляции проводят около пламени горелки по возможности быстро, чтобы не загрязнять культуру посторонними микроорганизмами.
Не рекомендуется делать резкие движения, ходить около проводящего посев, так как движение воздуха увеличивает вероятность
случайного загрязнения культуры.
39
Культивирование
Культивирование представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения
процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных
веществ среды. Существуют два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях
развития культуры.
На оптимальной питательной среде при благоприятных значениях рН и температуры, при условии подачи требуемого количества
воздуха в среду микроорганизмы быстро начинают расти и размножаться, обеспечивая накопление биомассы продуцента и биологически ценных метаболитов в культуральной жидкости.
Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные
ёмкости, в которых при определённых условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами
и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока
культуральной жидкости (при непрерывном культивировании). Для
поддержания кислородного режима ферментатор снабжается устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды – мешалками различной конструкции. Для поддержания температуры среды
предусмотрены системы охлаждения. Микробиологические методики, которые используют в молекулярной биотехнологии, очень просты и не должны представлять затруднений для тех, кто владеет основными приёмами работы в стерильных условиях.
Бактерии легко могут быть выращены в лабораторных условиях,
поэтому некоторые из них играют важную роль в генетических исследованиях. В идеальных условиях культура E. coli растет экспоненциально. Скорость роста культуры зависит от среды, генотипа штамма, температуры и аэрации. По мере увеличения плотности культуры
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]