Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Молекулярная биотехнология. Лабораторный практикум
.pdf
скорость деления клеток снижается до тех пор, пока бактерии не достигнут такой концентрации, при которой они больше уже не делятся,
но остаются жизнеспособными.
Наилучшей аэрации культуры достигают в том случае, если поместить колбу или пробирку в ротационную качалку или на вращающуюся
платформу. Объём сосуда должен, по крайней мере, в четыре раза превышать объём содержащейся в нём среды, чтобы его можно было энергично встряхивать (на ротационной качалке при 200 об/мин) [3, 4].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Материалы и оборудование
1. Чашка Петри с разлитой и застывшей твёрдой питательной
средой (Лурия – Бертани).
2. Металлическая петля.
3. Спиртовка, спички.
4. Термостат.
5. Дрожжевая суспензия.
6. Колонии кишечной палочки.
Ход работы
Выделение отдельных колоний производится методом рассева
штрихом.
Простерилизуйте металлическую петлю в пламени, пока она
не накалится до светло-красного цвета. Охладите её на воздухе (можно для более быстрого охлаждения воткнуть её в стерильную агаризованную среду).
Охлаждённой петлей захватите бактерии со старой чашки. Коснитесь петлей отдельной хорошо изолированной колонии, выросшей
на поверхности твёрдой среды. Нанесите прилипшие к петле бактерии штрихом на верхний сегмент чашки с агаром. Для посева колоний дрожжей металлической петлей нужно захватить часть дрожжевой суспензии из пробирки и аналогичным образом нанести дрожжи
на верхний сегмент чашки с агаром.
41
Один раз проведите петлей поперек первичного штриха и рассейте прилипшие к петле бактерии (дрожжи) по свежей области агаризов анной среды.
Затем снова проведите петлей поперёк на этот раз вторичного
штриха и снова рассейте прилипшие к петле бактерии (дрожжи)
по свежей области агаризованной среды. В результате Вы должны
получить (если все сделано правильно) на следующий день отдельные колонии бактерий (дрожжей).
Чашки с посеянными бактериями (дрожжами) поместите в термостат при температуре 37 °С.
Достаньте чашки из инкубатора, проверьте наличие колоний
и зафиксируйте результаты. Сравните внешний вид колоний кишечной палочки и дрожжей, сделайте выводы.
В течение нескольких недель колонии большинства штаммов
бактерий (дрожжей) могут храниться на поверхности агаризованной
среды, если чашки плотно заклеить парафином и держать перевернутыми при 4 °С в холодильнике или холодной комнате.
Контрольные вопросы
1. В чём отличие колоний кишечной палочки от колоний дрожжевых клеток?
2. Опишите методику получения изолированных колоний штриховым рас-
севом.
3. Перечислите особенности культивирования культуры E. coli в промыш-
ленных и лабораторных условиях.
4. Перечислите особенности культивирования культуры S. cerevisiae
в промышленных и лабораторных условиях.
5. Дайте общее представление о культивировании микроорганизмов.
6. Каково отношение микроорганизмов к молекулярному кислороду?
7. Перечислите способы культивирования аэробных микроорганизмов.
8. Перечислите способы культивирования анаэробных микроорганизмов.
9. Охарактеризуйте технику посева микроорганизмов в жидкие питатель-
ные среды.
10. Охарактеризуйте технику посева микроорганизмов на агаризованные
среды.
42
Лабораторная работа № 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА
В РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛАХ
Цель работы – определить количественное содержание белка
в растительных объектах.
Задачи работы – освоить методы Лоури: микробиуретовый, метод Лоури в модификации Харти, спектрофотометрический метод
определения белка в растительных материалах.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Белки (протеины, полипептиды) – высокомолекулярные биополимеры, состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью
альфа-аминокислот. Белки в большинстве случаев состоят
из 20 аминокислот, множество их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислоты в составе
белка часто подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою
функцию, и во время его «работы» в клетке. Функции белков в клетках живых организмов более разнообразны, чем функции других
биополимеров. Так, белки-ферменты катализируют протекание биохимических реакций и играют важную роль в обмене веществ.
Методы количественного определения белка
Основным требованием, предъявляемым к методу количественного определения белка, являются возможность его применения
в присутствии разнообразных внутриклеточных компонентов и нечувствительность к компонентам буферных смесей, используемых
для экстракции белков из клеток. В настоящее время не существует
метода количественного определения белка, который обладал бы
в равной степени специфичностью, чувствительностью, воспроизводимостью, быстротой и простотой проведения, а также отсутствием
влияния небелковых компонентов. У каждого метода определения
содержания белка есть свои преимущества и недостатки.
43
Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы.
Физические методы. Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки эти гигроскопичны,
и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот
способ применяется редко.
Из физических методов количественного определения белков
наибольшее распространение получили такие:
– рефрактометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра);
– полярографический (по кривым, показывающим зависимость
между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок);
– пиктографический метод (по плотности белковых растворов).
Химические методы количественного определения белков раз-
нообразны. Наиболее простой из них – количественное определение
общего или белкового (после осаждения белка и отделения его
от растворимых азотсодержащих веществ) азота (метод Кьельдаля).
Самым распространённым методом количественного определения белков является колориметрический. Основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии
белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать
концентрацию белка, строят калибровочный график. К таким методам также относят:
– биуретовую реакцию с использованием щелочного раствора соли меди;
– метод Лоури с применением реактива Фолина – Чокальтеу;
– метод Лоури в модификации Харти.
Биологические методы количественного определения белков
применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности
препарата, можно составить представление о содержании в нём белка, обладающего данной активностью. Этот метод не даёт абсолютных результатов.
44
Каждый из методов количественного определения белка имеет
свои достоинства и недостатки, но важно отметить, что ни один метод,
за исключением взвешивания сухого белка, не даёт однозначных и точных результатов в пределах нескольких процентов, если только он не
калиброван по белковому раствору того же состава. Практически это
означает, что истинно точное измерение можно провести лишь для чистых белков, после того как метод будет стандартизован. Для этого определяют сухой вес этих чистых белков, после того как метод будет
стандартизован, и строят соответствующую калибровочную кривую.
Однако если белок содержит небелковые простетические группы (углеводы, нуклеиновые кислоты), то определение сухого веса даёт значение
для всей молекулы, а не для её белковой составляющей.
Выбор метода определения белка
Важная роль в исследованиях отводится выбору наиболее подходящего метода определения белка для конкретного эксперимента.
Ошибки, допущенные при измерении концентрации белка, будут
приводить к накоплению общих ошибок в дальнейших расчётах.
Самые распространённые исследования, для которых требуется
предварительное определение содержания белка, – это изучение
свойств и функций белков, различные варианты хроматографического
и электрофоретического разделения белков (нативный и голубой нативный электрофорез, электрофорез в денатурирующих условиях, двумерный и диагональный электрофорез и др.). Для всех этих методов
имеет значение не только точность определения, но и возможность
проанализировать большое число образцов, различающихся как по составу белков, так и по составу буферов, для их корректного сравнения.
Один из наиболее ответственных моментов при определении
концентрации белка – выбор совместимого с анализируемым образцом метода. Поскольку все перечисленные выше методы основаны
на специфических свойствах белков, то состав белкового образца
и буфера являются главными критериями пригодности метода.
Состав белкового образца является решающим при выборе метода. Если в пробе преобладают белки, обогащённые аминокислотными
45
остатками аргинина, то при определении по Бредфорду результаты
будут завышены, тогда как при использовании метода Лоури или
ВСА (bicinchoninic acid, бицинхониновая кислота) они будут точнее.
Напротив, пробы с цистеин-богатыми белками будут давать завышенные результаты с ВСА, а применение методов Лоури или Бредфорда даст значения, близкие к истинным. В целом, если необходимо
определить содержание белка в сложных белковых смесях, то предпочтительнее методы Лоури и ВСА.
Состав буфера также очень важен. Метод Лоури высокочувствителен к такому часто используемому компоненту буферной смеси,
как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), которая мешает образованию хромофора. Метод ВСА совместим с широким спектром
детергентов, включая додецилсульфат натрия (ДДС-Na), но не допускает восстановителей, например дитиотреитола (ДТТ). Метод Бредфорда не подходит для высоких концентраций детергентов, но вполне
употребим для использования в присутствии восстановителей, таких
как ДТТ или 2-меркаптоэтанол.
Калибровочный график
Диапазон концентраций белка для калибровки зависит от выбранного метода. Например, метод Бредфорда довольно чувствительный, но калибровочный график имеет линейный участок в весьма узком интервале концентраций белка.
В идеальном случае калибровочный график нужно строить
в каждом опыте, что позволяет добиться более точных результатов.
Особенно это касается методов Лоури и ВСА, окраски в которых не
терминируется. В методе Бредфорда могут наблюдаться значительные сдвиги калибровочных кривых, поэтому для этого метода рекомендуется хотя бы периодически строить калибровочные графики.
При использовании коммерческих наборов и стандартизации процедуры (время, температура) воспроизводимость калибровочных графиков достаточно высока.
Как правило, для построения калибровочного графика служит
один стандартный белок, и очень важно выбрать его правильно. Если
46
стандартный белок выбран неудачно, то это может привести к значительным ошибкам (как в сторону завышения, так и занижения) в расчётах абсолютного содержания белка. Однако это не помешает проводить сравнительные исследования содержания белков в различных
образцах. Наиболее распространёнными стандартами являются бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин. Если для определения используется коммерческий набор для определения содержания белка (Kit), в составе которого имеется раствор стандартного белка (чаще всего это БСА) с известной концентрацией, именно его
и следует брать для построения калибровочного графика [3].
Определение белка по методу Лоури
Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой
реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10–100 мкг белка в пробе).
На развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации 0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол в концентрации
0,01–0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА в концентрации 0,5 мМ), детергенты (тритон X-100 в концентрации 0,1–0,2 %
вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации
0,15 %, сахароза в концентрации 10 % и др.
В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного
белка необходимо включить все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. B некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах или
очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов путём диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25.
Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.
47
Для исключения случайных ошибок, которые могут возникать
в процессе измерения, рекомендуется не ограничиваться одним измерением (готовят 2 ряда пробирок).
При определении концентрации вещества в растворе следует соблюдать следующую последовательность в работе:
а) построение калибровочной кривой для данного вещества;
б) измерение оптической плотности исследуемого раствора и оп-
ределение концентрации вещества в растворе по калибровочной кривой [4].
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Метод Лоури
Материалы и оборудование
1. Стандартный раствор альбумина 0,25 мг/мл.
2. 0,5 %-ный раствор карбоната натрия в 0,1 М растворе гидро-
ксида натрия (реактив № 1).
3. 0,5 %-ный раствор сернокислой меди в 1 %-ном растворе цит-
рата натрия (реактив № 2).
4. Непосредственно перед употреблением 1 мл реактива № 2
смешивают с 50 мл реактива № 1 – реактива № 3.
5. Реактив Фолина – Чокальтеу.
6. Образцы муки из зерна пшеницы первого и высшего сортов,
ржи, размолотые фасоль, горох, кукуруза, гречка, овес. Перед началом работы образцы и смешать с водой в соотношении 1:10 и оставить на 10–20 мин.
7. Пипетки вместимостью 1,2 см3.
8. Кюветы с рабочей длинной 10 мм, фотоколориметр.
9. Штатив с пробирками.
Ход работы
Используя стандартный раствор белка и дистиллированную воду
в 4 пробирках готовят растворы белка различной концентрации. Пятая проба не содержит белка и служит контролем на реактивы. В
шестую пробирку помещают 0,4 мл раствора белка неизвестной концентрации-Х (табл. 3.1).
48
Таблица 3.1
№ пробы
Концентрация
белка, мг/мл
Объём
стандартного
раствора
белка, мл
Объём
дистиллированной
воды, мл
Общий
объём
исследуемой
пробы, мл
1 0,1
0,3
0,4
2
0,120
0,2
0,2
0,4
3
0,183
0,3
0,1
0,4
4
0,250
0,4
0
0,4
5(К) 0 0
0,4
0,4
6(Х)
х
0,4(мг х)
0
0,4
Результаты эксперимента
Во все пробирки добавляем по 2 мл реактива № 3, смесь тщательно перемешивают. Через 10 мин добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чокальтеу. Реакционную смесь перемешивают и оставляют
при комнатной температуре на 30 мин.
Интенсивность окраски измеряют спектрофотометрически (при
длине волны 750 или 500 нм). Построение калибровочной кривой
производят следующим образом. Измеряют оптические плотности
каждого из этих растворов и строят график (калибровочную кривую),
откладывая по горизонтальной оси (ось абсцисс) известные концентрации, а по вертикальной оси (ось ординат) – соответствующие
им значения оптической плотности.
Пользуясь калибровочной кривой, определяют неизвестную концентрацию белка в исследуемом растворе, соответствующую измеренному значению оптической плотности.
B случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют CCl3COOH из такого расчёта, чтобы конечная концентрация её была равна 3–4 %. Раствор тщательно перемешивают и
оставляют на 10–20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием и промывают 2 %-ным раствором CCl3COOH. K осадку
добавляют 1–2 мл 1 н раствора щёлочи и осторожно подогревают до
растворения осадка белка. Раствор белка количественно переносят
49
в мерную колбу на 25–50 мл, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.
Микробиуретовый метод
В основе метода лежит образование фиолетового комплексного
соединения Cu2+ и пептида при обработке белка щелочным раствором CuSO4. Для развития окраски необходимо наличие, по крайней
мере, двух пептидных связей. Чувствительность метода 0,1–2 мг белка в пробе.
Материалы и оборудование
1. Стандартный раствор альбумина 1 мг в 1 мл.
2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедик-
та) – 17,3 г цитрата натрия и 10 г карбоната натрия – растворяют при
подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют
1,73 г сульфата меди, растворённого в 10 мл воды, и доводят водой
до 100 мл.
3. 6 %-ный раствор NaOH.
4. Лопатка, мерная колба вместимостью 100 мл, стаканы вмести-
мостью 50 мл, цилиндр вместимостью 25 мл.
5. Пипетки вместимостью 1,2 см3.
6. Кюветы с рабочей длиной 10 мм, фотоколориметр.
7. Штатив с пробирками.
Ход работы
К 2 мл раствора, содержащего 0,1–2,0 мг белка, добавляют 2 мл
6 %-ного раствора NaOH и 0,2 мл раствора Бенедикта. Раствор хоро-
шо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при длине волны
530 нм на фотоколориметре. Предварительно по стандартному рас-
твору белка строят график.
Для построения калибровочной кривой используют стандартный
раствор альбумина. Для каждой концентрации белка готовят не менее
трёх повторов. В табл. 3.2 приведен порядок заполнения проб и количество белка в каждой пробе.
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]