Теоретические основы биотехнологии. Учебно-методическое пособие

Ингибирование микробного роста, развития и размножения клеток

На уровне клеточного роста различают специфическое или

неспецифическое (множественное) ингибирование со стороны компонентов окружающей среды.

Специфические ингибиторы, в первую очередь, антибиотики,

приводят к гибели клеток вследствие избирательного ингибирования синтеза клеточных полимеров, а ингибиторы множественного неспецифического действия оказывают прямое губительное действие на микробные клетки.

Неспецифические ингибиторы роста оказывают многостороннее действие на обмен веществ. К ним, прежде всего,

относятся тяжелые металлы. Их ингибирующее действие проявляется в инактивации ферментов. Они могут связываться с активным центром фермента, изменять конформацию молекулы фермента,

вытеснять другие металлы, входящие в состав ферментов.

Степень токсичности тяжелых металлов совпадает со способностью их образовывать комплексы с функциональными группами веществ клетки и прочностью образуемых комплексов.

Тяжелые металлы ингибируют процесс дыхания, влияют на проницаемость и транспортный аппарат клетки.

Физиологическое состояние культуры дрожжей р. Candida

при воздействии на нее ингибитора

Ионы меди поступают в клетки р. Candida путем активного транспорта. Медь постоянно накапливается в клетках и

71

Лабораторная работа 3. Изучения влияния ингибиторов на рост микробной культуры методом острых опытов

Цель и задачи работы: получить комплекс экспериментальных данных, характеризующих влияние ингибиторов на рост экспоненциально растущей культуры и определить тип ингибирования, используя зависимость Лайнуивера-Берка

(1/µ = f(1/S)).

Метод острых опытов изучает влияние ингибитора на поведение экспоненциально растущей культуры. Такого рода исследования позволяют выявить механизм ингибирования биосинтеза микробных полимеров и установить ингибирование синтеза конкретных биополимеров (белки микробной массы, липиды клетки,

нуклеиновые кислоты и др.).

Для этого к экспоненциально растущей культуре добавляются различные дозы ингибитора и в течение 1,5-6 часов ведутся наблюдения за кинетикой роста в опыте и контроле.

Важно найти ту дозу (концентрацию) ингибитора, которая действует на наиболее чувствительное звено метаболизма (большие дозировки специфических ингибиторов могут действовать на несколько функций).

Также очень важна длительность опыта: чем она короче, тем точнее информация, т.к. повреждение одного звена метаболизма быстро отражается на многих других. Культивирование должно быть достаточно коротким для того, чтобы другие факторы среды, кроме добавленного ингибитора, не успели оказать своего действия.

Кроме того, в процессе исследований следят за выживаемостью неразмножающихся клеток в присутствии ингибитора.

74

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- посевной материал – суспензия дрожжей (р.p. Saccharomyces

или Candida) 200-300 мл на весь эксперимент;

-перемешивающее устройство (качалка) – 2, 4, 6 шт.;

-весы – 2 шт.;

-фотоэлектроколориметр (2 шт.) и кюветы (на 5 мл);

-качалочные колбы (9 шт. на одну качалку) объемом 100 мл;

-питательная среда с раствором микроэлементов и витаминов;

-этанол как субстрат (S = 0,1 %; 0,3 %; 0,5 %);

-ингибитор – 1 % раствор CuSO4×5H2O;

-пипетки мерные объемом 10 мл – 6-8 шт.;

-пипетки мерные объемом 1 мл – 6-8 шт.;

-конические колбы объемом 250 мл – 6-8 шт.;

-пробирки со штативом (на 1 опыт, на 1 бригаду) – 5-6 шт.;

-мерные колбы объемом 50 или 100 мл – 4 шт.;

-мерные колбы объемом 500 мл – 2 шт.;

Экспериментальная часть

1. Провести короткое (до 12 часов) культивирование дрожжей р.

Candida (Erwinia) на питательной среде (ПС) с различными начальными концентрациями углеродного субстрата (этанола): 0,1 %; 0,3 %; 0,5 %. Внесение остальных компонентов питательной среды проводить согласно указаниям в лабораторной работе 2.

Условия периодического культивирования с использованием перемешивающего устройства («качалки»): t = 36 oС, n = 220 об/мин.

По окончании лаг-фазы в начале экспоненциальной фазы роста

(обычно через 1,5 часа для данных условий культивирования)

добавить в среду ингибитор – 1 % раствор CuSO4×5Н2О. Провести 12

75

часовые контрольные (без ингибитора) и опытные (с ингибитором)

ферментации.

Схема ферментации представлена ниже:

внести в 9 качалочных колб по 20 мл в каждую колбу;

б) с ингибитором (опыт):аналогично а) + 0,5 мл 1% раствора

S=0,5 %

внести в 9 качалочных колб по 20 мл в каждую колбу.

2. Для анализа роста биомассы определить оптическую плотность (D) образцов дрожжевых суспензий в контрольной и опытной ферментациях. Полученные экспериментальные данные позволяют построить кривые роста дрожжевой культуры D = f(τ) и

определить из них логарифмическую фазу роста.

Расчетно-аналитическая часть

1.Построить кривые роста периодической культуры D = f(τ) и

определить из них логарифмическую фазу роста.

2.Определить значения удельной скорости роста μ для логарифмической фазы роста (пользуясь тремя значениями для

76

контрольных ферментаций и тремя – для опытных при трех различных концентраций субстрата).

3. Результаты свести в таблицу 3.1. (Значения концентрации субстрата (этанола) для построения зависимостей Лайнуивера-Берка следует представить в г/л с учетом плотности этанола 0,8 г/см3 при температуре 20 оС).

Таблица 3.1 – Экспериментальные данные и расчетные показатели серии ферментаций в методе острых опытов

10

23

36

49

512

Результаты ферментаций с начальной концентрацией этанола 0,3 %

10

23

36

49

512

Результаты ферментаций с начальной концентрацией этанола 0,5 %

10

23

36

49

512

* Значения D для 3,4 и 5 проб (6,9 и 12 часов ферментации соответственно)

следует указывать с учетом разбавления проб в 10 раз (т.е. экспериментально измеренные значения следует умножить на 10)

4. Построить зависимости Лайнуивера-Берка (1/µ = f (1/S)) и

графически определить тип ингибирования.

77

Контрольные вопросы

1.Для каких исследовательских целей применяется метод острых опытов?

2.Какие условия должны соблюдаться при использовании метода острых опытов для изучения экспоненциально растущей культуры?

3.Приведите пример механизма действия неспецифического ингибитора.

4.Приведите пример механизма действия специфического ингибитора.

5.Как вы понимаете термин «степень токсичности»?

6.Для каких целей используются ингибиторы неспецифического действия?

7.Каким образом ионы Cu2+ поступают в клетки культуры р.

Candida?

8. Опишите физиологическое состояние культуры р. Candida

при воздействии на нее ионов меди?

9.При каком способе культивирования (периодическом или непрерывном) клетки могут выдержать более высокую концентрацию ингибитора?

10.Объясните характер графиков для различных типов ингибирования (конкурентного, неконкурентного, смешанного).

79

Литература

1. Роботнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М.:

Наука, 1979. – 208 с.

2. Печуркин Н.С. и др. Популяционные аспекты биотехнологии/

Н.С. Печуркин, А.В. Брильков, Т.В. Марченкова. Новосибирск:

Наука, 1990. – 112 с.

3.Ашмарин И.П., Ключарёв Л.А. Ингибиторы синтеза белка. –

Л.: Медицина, 1975. – 208 с.

4.Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

5.Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы

технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат,

1990. – с. 144-172, 144-270.

80