Теоретические основы биотехнологии. Учебно-методическое пособие

Экспериментальная часть

1. Предварительно перемешав исходную суспензию микроорганизмов, разлить её в лабораторные стаканчики, откуда отобрать по 3-5 мл в 4 пробирки.

Примечание: для подсчета исходного числа клеток использовать одну из пробирок (нулевая проба (х0)).

2. Каждой бригаде поместить 3 пробирки в 3 водяные термостатируемые бани с заданными температурами эксперимента

(Т = 65 оC, 85 оС и 100 оС).

3. Через определенные промежутки времени (15 минут)

отбирать из пробирок пробы микробных суспензий для подсчета числа клеток.

4. Произвести подсчет общего числа клеток в отобранных пробах с использованием счетных камер Горяева-Тома, а также числа живых клеток с предварительным окрашиванием проб микробных суспензий.

Подсчет клеток в счетных камерах

Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис. 1.2), хотя можно применять и другие.

Эта камера представляет собой толстое предметное стекло,

разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон

21

предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат)

или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на

0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда

указывается на предметном стекле.

б

а– вид сверху; б – вид сбоку;

в– вид сетки камеры при малом увеличении микроскопа

Рис. 1.2 – Камера Горяева-Тома

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере,

соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в водной плоскости. Подвижные

22

103 – коэффициент перевода см3 в мм3; n – разведение исследуемой суспензии.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых

25 разделены на 16 малых квадратов, 100 – на прямоугольники и

100 остаются чистыми.

Каждая их 15 вертикальных и горизонтальных полос сетки Горяева имеет ширину, равную 1/5 мм, причем каждая третья полоса разделена в свою очередь на 4 узкие полоски шириной

1/20 мм, при пересечении которых образуются маленькие квадратики площадью 1/400 мм2. Они составляют 25 групп из 16

квадратиков. Для подсчета используются большие квадраты,

разделенные на 16 маленьких.

Расчетно-аналитическая часть

Оценить эффективность обеспечения асептики жидкой среды вследствие её термообработки при различных температурах. Для

этого:

1. Вычислить х – общее число клеток, а также число живых клеток в 1 мл суспензии и построить графическую зависимость

х = f(τ); проанализировать кинетику гибели микробных клеток во временных интервалах от 0 до 30 минут и от 30 до 60 минут.

Сделать вывод об влияния температуры и продолжительности термообработки на эффективность стерилизации среды.

2. Вычислить значение критерия стерилизации ln [[ххо]] .

24

3. Определить удельную скорость гибели k микроорганизмов при заданной температуре (Т = 65 оС, 85 оС, 100 оС) по уравнению

(1.1).

Результаты экспериментальных данных и расчетов представить в виде таблицы 1.3.

Таблица 1.3 – Экспериментальные данные и показатели термической стерилизации

4.Рассчитать время, за которое концентрация выживших клеток снижается в 10 раз.

5.Построить графическую зависимость в координатах lnk = f(1/T) (Т приводится в градусах Кельвина). Для построения зависимости использовать значения удельной скорости гибели k

живых (неокрашенных) клеток в анализируемых пробах.

lnk

lnA

α

1/T

Рис. 1.3 – Графическая зависимость k от 1/Т

25

Из графика (рис. 3.1) найти tgα и точку пересечения с осью ординат. В линеаризованном виде уравнение Аррениуса может

Здесь lnA определяется из графика как величина, численно равная величине отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат, а

Е = tgα . R

Таким образом, значение удельной скорости гибели определяется из уравнения Аррениуса с найденными константами:

А и Е/R.

Эффективность термообработки для обеспечения асептики жидких сред может быть оценена для любой температуры: так как

А, Е, R – постоянные величины, подставив в уравнение Аррениуса

(1.3) любое значение Т, рассчитывается k.

26

Контрольные вопросы

1.Асептика, асептические условия, стерильность.

2.Какое влияние оказывает посторонняя микрофлора на эффективность микробиологических производств? Приведите примеры.

3.Каким образом обеспечивается достижение и поддержание асептических условий на стадии ферментации?

4.Термическая стерилизация.

5.Химическая стерилизация.

6.Стерилизация ионизирующим излучением.

7.Фильтрующая стерилизация.

8.Проанализируйте существующие способы и режимы стерилизации. Какие пути повышения эффективности режимов стерилизации жидкостей вы знаете?

9.Методы и режимы получения стерильного воздуха.

27

Литература

1.Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. –

М.: КолосС, 2004. – 296 с.

2.Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995.

–600 с.

3.Кантере В.М. Теоретические основы технологии

микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. –

271 с.

4. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы

технологии микробиологических производств. – М.:

Агропромиздат, 1990. – с. 210-213.

5.Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии. – М.: Агропромиздат, 1985. – 224 с.

6.Матвеев В.Е. Основы асептики в технологии чистых

микробиологических препаратов. – М.: Легкая и пищевая пром-сть,

1981. – 312 с.

7.Биотехнология: уч. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова; В.Д. Самуилова. Кн. 1. – М.: Высшая школа, 1987. – 159 с.

8.Беккер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.

9.Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

28

Тема 2. Метаболизм углеродсодержащего субстрата.

Способы культивирования дрожжей на различных углеродных субстратах

Живая клетка – сложный биохимический реактор для проведения более 1000 независимых одновременно протекающих биокаталитических процессов превращения веществ, совокупность которых называется метаболизмом клетки.

Процессы метаболических превращений сложных веществ

(полисахаридов, липидов, белков и др.) в простые (например, СО2 и

Н2О) с целью получения энергии (для энергетического обмена)

называются катаболическими, а их совокупность – катаболизмом

клетки.

Процессы метаболических превращений с целью построения клетки с биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, липидов,

полисахаридов и др. сложных, богатых энергией веществ из простых (для конструктивного обмена) являются энергопотребляющими и называются анаболическими, а их совокупность – анаболизмом клетки.

Процессы биосинтеза низкомолекулярных веществ – аминокислот, нуклеотидов, моносахаридов – компонентов для биосинтеза биополимеров - белков, нуклеиновых кислот, липидов,

полисахаридов называются амфиболическими, а их совокупность –

амфиболизмом клетки. Амфиболические процессы обеспечивают клетку энергией и исходными для анаболизма веществами.

Метаболические процессы и реакции в клетке объединяются в определенные последовательности, называемые путями метаболизма.

29