Теоретические основы биотехнологии. Учебно-методическое пособие

Контрольные вопросы

1.Проведите сравнительный анализ роста дрожжей на глюкозе и этаноле. Объясните биохимические особенности утилизации того или иного субстрата, используя рис. 2.2.

2.Почему клетке, способной ассимилировать С2-соединения,

необходим глиоксилатный шунт?

3.В каких условиях клетки дрожжей образуют уксусную кислоту?

4.Объясните роль источников минерального питания и факторов роста, которые вносятся в питательную среду для культивирования дрожжей.

5.Перечислите основные контролируемые и регулируемые параметры процесса культивирования дрожжей.

6.Каков критерий окончания процесса культивирования?

7.Каковы характерные признаки различных фаз роста?

8.Увеличиваются ли затраты на поддержание жизнедеятельности дрожжей в стационарной фазе роста?

9.На какой фазе роста содержание белка в клетках максимально?

10.Существует ли прямая корреляция между удельной скоростью роста и содержанием белка в биомассе?

11.Какие показатели относятся к кинетическим характеристикам роста культуры?

12.Какие показатели описывают стехиометрию роста микроорганизмов?

61

Литература

1.Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.:

Высшая шк., 2004. – 356 с.

2.Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы

технологии микробиологических производств. – М.:

Агропромиздат, 1990. – с. 97-99, 173-205.

3. Еникеев Ш.Г., Белялова З.М., Валеев Р.И. и др. Получение микробной биомассы на основе этилового спирта. – Казань: КХТИ,

1988. – 32 с.

4. Кантере В.М. Теоретические основы технологии

микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. –

271с.

5.Решетник О.А. Общая микробиология. – Казань: КХТИ, 1984. – с. 59-66.

6.Егоров Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Академия, 2003. – 208 с.

7.Микробная биотехнология / Лещинская И.Б. Куриненко Б.М., Вершинина В.И. и др. – Казань: Унипресс: ДАС, 2000. – 368 с.

8.Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995.

–600 с.

9.Беккер М.Е., Лиепиныш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.

10.Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова.

–М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

62

Тема 3. Ингибирование роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования

В процессе микробного роста в клетках протекают разнообразные биокаталитические реакции, которые протекают с участием множества ферментов.

Описание кинетики ферментативных реакций

При взаимодействии фермента (E) с субстратом (S) образуется

фермент-субстратный комплекс (ЕS) за счет сил физической природы. Различают 2 стадии ферментативной реакции, из которых собственно только вторая является биохимическим каталитическим превращением:

химическая реакция

Скорость образования продукта (Р) равна:

Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (ES)

определяется как

Общая концентрация фермента (E0) определяется суммарной

концентрацией индивидуального фермента и фермента, связанного в комплексе с субстратом:

63

k+2 [E0] – максимальная скорость ферментативной реакции Vmax,

когда [ES]=[ E0], т.е. весь фермент связан в фермент-субстратном

Уравнение (3.9) представляет собой уравнение Михаэлиса-

Ментен, которое учитывает лимитирование скорости реакции концентрацией субстрата. Этим уравнением Л. Михаэлис и М.Л.

Ментен в 1913 году описали кинетику простых ферментативных реакций, не осложненных цепью сложных и разветвленных превращений субстрата в различные продукты, а также не связанных с ингибированием фермента.

64

В уравнении (3.9) константа Михаэлиса Km является мерой сродства фермента к субстрату и численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине от максимальной (V=Vmax/2).

Чем меньше значение Km, тем выше сродство фермента к данному субстрату, субстрат быстрее претерпевает превращение, т.е.

быстрее протекает ферментативная реакция.

Графическим образом уравнения Михаэлиса-Ментен является гипербола (рис. 3.1). Как любая нелинейная функция, она неудобна для нахождения параметров уравнения – Km и Vmax.

Рис. 3.1 – Гипербола – графический образ уравнения Михаэлиса-

Ментен

65

Для нахождения численных значений Km и Vmax уравнение приводят к линейной зависимости (y=a+bx) различными способами.

Наиболее традиционным является зависимость Лайнуивера-Берка,

представляющая собой уравнение Михаэлиса-Ментен в обратных

Таким образом, параметры уравнения Михаэлиса-Ментен легко найти из линеаризованного уравнения y=a+bx (рис. 3.2):

а = 1/Vmax (отрезок на пересечении прямой с осью у (1/V)); b = Km/Vmax (тангенс угла наклона прямой к оси x (1/S));

или -1/Km (отрезок на пересечении прямой с осью x (1/S)).

1/V

1/Vmax

Рис. 3.2 – Зависимость Лайнуивера-Берка – линеаризованное уравнение Михаэлиса-Ментен

66

Описание кинетики микробного роста

В 40-х годах 20-го века Ж. Моно (Monod) показал, что достаточно удачным и универсальным для описания роста большинства микробных культур является уравнение, вид которого аналогичен уравнению Михаэлиса-Ментен, которое использовалось для фундаментального описания кинетики ферментативных реакций,

в том числе внутри микробных клеток.

Таким образом, рост микроорганизмов зависит от питания

(субстрата) и для большинства микроорганизмов описывается

уравнением (моделью) Моно. Графическим образом уравнения Моно также является гипербола (рис. 3.3), а уравнение записывается с учетом лимитирующего действия субстрата на рост

микроорганизмов:

рис. 3.3 наименьшее значение KS отличает наиболее усвояемый субстрат (например, глюкозу); большее значение KS’ может соответствовать менее усвояемому субстрату (например, галактозе),

самое большое значение KS’’ может характеризовать наименее усвояемый субстрат (например, янтарную кислоту).

67

Кинетика ферментативных реакций с ингибированием фермента

Прежде всего, ингибирующее действие на ферменты микроорганизмов и, соответственно, на их рост может оказывать субстрат в высоких концентрациях. С учетом ингибирующего действия субстрата на фермент уравнение Михаэлиса-Ментен записывается следующим образом:

где Ki – константа ингибирования субстратом.

Далее, кроме субстрата, не оказывающего ингибирующего действия, во взаимодействие с ферментом может вступать вещество-

ингибитор, снижающее активность фермента и конкурирующее или

неконкурирующее с субстратом за активные центры фермента.

При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же (!) активным центром фермента:

фермента к субстрату (т.е. повышается значение Кm). Величина Vmax

не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат

69

вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом. В этом случае

ингибирование имеет обратимый характер.

Для случая конкурентного ингибирования уравнение

Михаэлиса-Ментен выглядит следующим образом:

связываются с разными (!) активными центрами фермента.

k-1

k+3

E + I EI E + P

k-3

непродуктивный

комплекс

При этом величина Кm не изменяется, а величина Vmax

снижается.

Уравнение Михаэлиса-Ментен с учетом неконкурентного

ингибирования:

Аналогично, фермент может подвергаться конкурентному или неконкурентному ингибированию продуктом реакции (Р):

При рассмотрении ингибирования ферментов следует отметить,

что оно может быть обратимым или необратимым, когда активность фермента соответственно восстанавливается или не восстанавливается после удаления ингибитора из среды.

70