Теоретические основы биотехнологии. Учебно-методическое пособие

КН2РО4 – 6,8 г/л;

2) для культивирования дрожжей р. Saccharomyces:

(NH4)2SO4 – 5-10 г, СаCl2×4 H2O – 1 г, MgSO4×7 H2O – 7-10 г, NaCl – 5-10 г, KH2PO4 – 30-40 г, K2HPO4 – 1 г.

Приготовленную минеральную среду объемом 250 мл

стерилизуют в автоклаве 1 час под давлением 1 атм 10-20 мин.

Раствор микроэлементов готовят и стерилизуют отдельно. В

100 мл дистиллированной воды растворяют 1,25 г FeSO4, 1,25 г MnSO4, 1,25 г ZnSO4, 0,63 г NaCl и добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Приготовленный раствор стерилизуют при 1 атм 10-20 мин и стерильно вносят в колбу с ранее приготовленной минеральной средой из расчета 1 мл на 1 л

минеральной среды.

Далее раствор стерильно разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 100 мл и закрывают ватно-марлевыми пробками.

Вколбы с раствором стерильно добавляют 1 % об.

дрожжевого автолизата в качестве фактора роста (источника витаминов, аминокислот, ферментов и т.п.), а также приготовленные ранее растворы, содержащие источники углерода

(внимание: этанол вносится в колбы вдали от пламени !).

Затем в качалочные колбы с питательной средой вносят инокулят из расчета 1 мл приготовленной суспензии дрожжевых клеток на 20 мл питательной среды.

Построение калибровочного графика

Построить калибровочный график зависимости оптической плотности дрожжевой суспензии D от концентрации биомассы суспензии Х.

51

Пользуясь препаратом дрожжевой суспензии «раздавленная капля», в рабочих тетрадях изображают морфологическую картину для каждой отобранной пробы и анализируют наличие гликогена в клетках дрожжей.

Методы аналитических исследований

Определение оптической плотности культуральной жидкости

Оптическая плотность служит качественным показателем содержания биомассы в культуральной жидкости. Для определения оптической плотности применяют фотоэлектроколориметр. При приготовлении суспензии клеток учитывают, что наиболее точные результаты получают при работе с суспензиями, имеющими показатели на среднем участке измерительной шкалы. Для разбавления суспензий используют водопроводную воду.

Измеряют светорассеяние суспензий с помощью кюветы с длинной светового пути 0,5 см при длине волн 490 нм (зеленый светофильтр).

Подсчет числа клеток в культуральной жидкости производят с помощью счетной камеры Горяева-Тома, при микроскопировании проб с 40-кратным объективом.

Определение содержания этанола.

1. Для качественного определения этанола в культуральной жидкости (КЖ) проводится смешение её проб с серной кислотой и раствором бихромата калия по следующей схеме:

1 мл Н2SО4 (конц.)

+ 0,2 мл К2Cr2О7 (2%-ный раствор)

53

+ 1 мл КЖ (отфильтрованная проба)

Цвет раствора характеризует степень присутствия этанола в

пробе:

голубой цвет – много этанола зеленый цвет – достаточное количество этанола желтый цвет – отсутствие этанола.

2. Для количественного определения содержания этанола могут быть применены 2 метода.

2.1. Метод газохроматографический.

Определение производят с помощью газового хроматографа снабженного пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента используют PORAPAC-QS, в процессе определения поддерживают температуру колонок 180 оС. В качестве газа-

носителя применяют инертные газы (гелий или азот). Температура испарителя – 220 оС. При расходе газа-носителя 4,2 л/мин этанол регистрируется на 5-6 минуте после ввода пробы. Для контроля вводят определенное количество этанола и по соотношению высоты пиков контроля и пробы судят о концентрации этанола в

среде.

2.2. Оксидиметрический метод основан на окислении этанола до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной

кислотой.

3СН3СН2ОН + 2К2Cr2О7 + 8Н2SО4 → 3СН3СООН + 2Cr(SO4)2 + + K2SO4 + 11H2O

Избыток бихромата оттитровывают раствором соли Мора.

К2Cr2О7 + 6FeSO4×(NH4)2SO4 + 7Н2SО4 → Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)2 + + 6(NH4)2SO4 + 7H2O + K2SO4

54

По количеству бихромата, израсходованного на окисление,

вычисляют концентрацию этанола.

Для определения концентрации этанола в мерную колбу вносят 20 мл культуральной жидкости, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Затем отбирают 10 мл пробы в круглодонную колбу емкостью 50-75 мл, горлышко плотно закрывают резиновой пробкой с вмонтированной в нее газоотводной трубкой. В трехгорловую колбу вносят 25 мл раствора бихромата и 10 мл концентрированной серной кислоты.

Конец отводной трубки должен доходить почти до конца приемника. Отгонка длится 10-15 минут. За время отгонки приемная колба должна быть заполнена на 2/3 объема колбы.

Окраска раствора меняется от оранжевой до грязно-бурой.

Содержимое приемника переносят в мерную колбу на 100 мл, туда сливают промывные воды от приемника и отводной трубки,

доводят до метким дистиллированной водой и перемешивают.

Отбирают 20 мл в коническую колбу на 250 мл, добавляют туда

20 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора.

Одновременно ведут контрольное титрование следующим образом. В коническую колбу на 250 мл помещают 5 мл раствора бихромата, 2 мл концентрированной серной кислоты, 30-40 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора. Конец титрования устанавливают капельной пробой с раствором феррицианида. Ее проводят на белой фарфоровой пластинке с помощью стеклянной палочки. Капают по капле раствор феррацианида и титруемую жидкость. Интенсивное синее окрашивание свидетельствует о конце титрования. Количество

55

этилового спирта в г/л культуральной жидкости рассчитывают по

формуле

соответственно;

25 – количество К2Cr2О7 в мл;

5 – разведение культуральной жидкости;

0,01 г этанола соответствует 1 мл К2Cr2О7.

Необходимые растворы: Н2SO4 (уд. вес 1,84), раствор К2Cr2О7

– 42,6 г/л, раствор соли Мора FeSO4×(NH4)2SO4 – 92 г и Н2SO4 –

20 г в 1 л воды, раствор феррицианида – 0,2 г/л.

Определение содержания глюкозы в питательной среде и культуральной жидкости (по реакции Фелинга)

Метод основан на восстановлении меди моносахаридами из окиси меди (II) в окись меди (I). Моносахариды в этой реакции выступают в качестве восстановителей меди и поэтому называются

редуцирующими веществами (англ. reduction – восстановление).

При проведении реакции используется реактив Фелинга,

представляющий собой смесь растворов сульфата меди и сегнетовой соли (калий натрий виннокислый) в щелочной среде.

При смешивании сульфата меди со щелочью происходит реакция:

CuSO4 + 2NaOH→ Cu(OH)2 + Na2SO4

В присутствии сегнетовой соли выделившийся гидрооксид меди (II) не выпадает в осадок, так как образует комплексное

56

соединение. Медь (II) восстанавливается в присутствии моносахаридов с образованием окиси меди (I). Количество выпадшего осадка Сu2O (красно-бурого цвета) зависит от природы и количества редуцирующих веществ в пробе, состава жидкости Фелинга, ее щелочности, общего объема нагреваемой жидкости,

температуры и длительности нагревания.

В результате этой реакции альдегидная или кетонная группа моносахарида окисляется до карбоксильной группы:

В зависимости от содержания углеводов в исследуемой жидкости, для анализа надо брать следующее количество пробы:

а) до 30 часов роста культуры – 0,5 мл б) до 48 часов роста культуры – 1 мл

Для анализа отобрать 0,5 мл культуральной жидкости в колбу объемом 100 мл (250 мл), добавить 9,5 мл H2O и по 10 мл растворов Ф1 (CuSO4× 5H2O) и Ф2 (COOK ─ CHOH ─ CHOH ─ COONa × 4H2O), и смесь нагревают на электроплитке в течение 3 минут с момента появления первого пузырька. Затем смесь охлаждают и в колбу вносят 15 мл 20 % раствора H2SO4 и 5 мл 40 % раствора KJ.

Выделившийся J2, оттитровывают 0,1 н раствором Na2S2O3. В конце титрования вносят в колбу несколько капель 0,5 % раствора

57

крахмала. Крахмал нужно добавлять в конце титрования, т.к. если добавлять его сразу, то образуется комплекс меди с крахмалом,

который медленно реагирует с гипосульфитом натрия (Na2S2O3).

Раствор в колбе должен приобрести сначала грязно-синий цвет, а

по окончании титрования молочную окраску.

Аналогично готовят контрольную пробу, в которой вместо культуральной жидкости для анализа используется 10 мл H2O.

Далее реакцию проводят согласно вышеописанной методике.

Используя данные титрования и учитывая разность объемов титранта (Na2S2O3) между контрольной и опытной пробами ( V),

по калибровочному графику V = f (С) определяем концентрацию редуцирующих сахаров (С). Этим методом определяют содержание в культуральной жидкости гексоз – основного источника углерода для большинства микроорганизмов.

Выявление запасного энергетически важного запасного вещества дрожжевой клетки – гликогена

На предметном стекле приготовить препарат «раздавленная капля». Добавить каплю раствора Люголя. Микроскопировать под увеличением в 40 раз. Гликоген в дрожжевых клетках окрашивается в красновато-бурый цвет.

Определение количества белка в биомассе

Метод основан на том факте, что спектрофотометрически максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм. Он обусловлен присутствием в белках ароматических аминокислот – тирозина и триптофана. Диапазон колебаний отношений их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок.

58

3.Вычислить значения удельной скорости роста µ по фазам

роста.

4.Рассчитать значения экономического коэффициента и метаболического коэффициента по фазам роста.

5.Вычислить значения выхода по энергии, кислороду и белку для процесса культивирования дрожжей, формула биомассы которых принять по Стоутхамеру СН1,8O0,5N0,2.

Результаты экспериментальных исследований и расчетов

свести в табл. 2.3 и 2.4.

Таблица 2.3 – Экспериментальные данные, полученные при культивировании дрожжей

Таблица 2.4 – Расчетные показатели культивирования дрожжей по

фазам роста

60