Теоретические основы биотехнологии. Учебно-методическое пособие

толщину слоя фильтрующего материала. Например, если степень улавливания фильтром частиц определенного размера составляет

90 %, то увеличение толщины слоя фильтра вдвое приведет к повышению этой цифры до 99 % и т. д. Так можно добиться почти

100 % -ного улавливания твердых частиц определенного размера,

используя фильтр с порами гораздо большего размера, но достаточной толщины. Напомним еще раз, что это относится только к фильтрующей стерилизации газов; при фильтрации жидкостей основной механизм улавливания – прямой перехват.

Любой фильтр можно охарактеризовать максимальным размером пор (улавливание частиц большего размера в нем абсолютное), а также зависимостью удерживающей способности фильтра от размера частиц меньше диаметра пор при определенном режиме фильтрации.

Фильтры для тонкой и стерилизующей фильтрации подразделяют на поверхностные и глубинные. К поверхностным относятся плетеные сетчатые фильтры, а также мембраны,

имеющие прямые сквозные отверстия. В фильтрах этого типа частицы удерживаются в основном на поверхности фильтра, что приводит к быстрому забиванию пор и прекращению фильтрации.

Такие фильтры можно использовать для обработки предварительно очищенных от большей части загрязнений жидкостей и газов.

Фильтры глубинного типа, в которых задержание частиц происходит по всему объему материала, имеют хаотически расположенные поры. Их в свою очередь можно разделить на фильтры, поры которых не увеличиваются при возрастании

13

давления (мембранные фильтры), и у которых поры увеличиваются при увеличении давления (например, фильтры с набивкой из хлопчатобумажных нитей). Фильтры с увеличением пор имеют низкие эксплуатационные характеристики и плохо удерживают частицы в условиях пульсации давления.

Особенность процесса стерилизующей фильтрации в биотехнологических производствах состоит в том, что здесь требуется полное задержание бактерий, представляющих собой очень мелкие частицы (самые мелкие бактерии имеют размер

0,3 мкм). Это обусловливает необходимость использования многостадийных систем очистки с применением разных типов фильтров на различных стадиях.

При разделении биологических суспензий, т.е. при отделении клеток микроорганизмов, а также частиц – вирусов,

мелкодисперсных и коллоидных примесей, макромолекул (белков,

ферментов, нуклеиновых кислот) от культуральной жидкости используются следующие методы фильтрации:

1) собственно фильтрация через тканевые фильтры – для отделения частиц размером от 10 мкм до 1 мм (мелкодисперсных примесей, развитого мицелия грибов). Мицелиальные грибы имеют размеры микроколоний до 1 мм, что упрощает их отделение от жидкости. Кроме того, в жидкой фазе могут присутствовать нерастворимые компоненты питательной среды, как, например,

мука, дробина, применяемые в спиртовом производстве. Тонкие

взвеси этих компонентов имеют размеры от 10 до 100 мкм, а грубые взвеси – от 100 мкм до 1 мм;

14

2) микрофильтрация – для отделения частиц размеров от

200 нм до 10 мкм (мицелия грибов, крупных клеток дрожжей,

эритроцитов). Наиболее крупные клетки дрожжей имеют размеры

до 15-20 мкм;

3) ультрафильтрация – для отделения частиц размером от

10 нм до 5 мкм (клеток дрожжей, бактерий, некоторых вирусов,

макромолекул). Этим методом могут успешно отделяться клетки дрожжей, размеры которых составляют от 3 до 5 мкм;

бактериальные клетки, имеющие размеры от 0,3 до 1 мкм, вирусы с размером больше 10 нм, а также ферменты, нуклеинов кислоты и

другие макромолекулы размером от 10 до 120 нм.

II. Химическая стерилизация – основана на применении различных химических соединений: окиси этилена,

β-пропиолактона, растворов хлорамина, карболовой кислоты,

фенола, 70 % раствора этанола и др. Этот метод чаще всего

используется для стерилизации поверхностей, посуды,

инструментов, удаления микроорганизмов из отработанных питательных сред.

материалы содержат некоторое количество воды (5-15 %). Окись этилена применяют в виде газовой смеси (с N2 или СО2), в которой ее доля составляет от 2 до 50 %.

15

2.β-пропиолактон – применяют для стерилизации

клетки и споры. Далее β-пропиолактон произвольно гидролизуется до карбоновых кислот, являющихся дополнительным субстратом.

для стерилизации посуды, инструментов и поверхностей.

Основные методы стерилизации представлены в таблице 1.2.

Таблица 1.2 – Методы стерилизации оборудования, питательных

сред и воздуха

16

Продолжение таблицы 1.2

17

Лабораторная работа 1. Изучение кинетики гибели микроорганизмов

Цель и задачи работы: определить основные показатели,

которые характеризуют эффективность термической стерилизации среды для обеспечения её асептики (100 % - ной гибели микроорганизмов).

Гибель части клеток в процессе роста популяции учитывается большинством моделей как процесс, протекающий параллельно и независимо от размножения жизнеспособных особей той же культуры.

В ряде случаев, а именно при стерилизации жидких и твердых сред, оборудования, вспомогательных материалов, гибель части или всех клеток становится целью процесса.

Такая постановка задачи требует таких методов решения,

которые способны гарантировать асептику среды и воспроизводить результаты в промышленных условиях при длительной эксплуатации установок.

Основным методом стерилизации жидкостей и аппаратуры в лабораторных условиях является термический, связанный с достаточно длительным прогревом до заданной температуры.

Гибель микроорганизмов при повышенной температуре происходит, как правило, со скоростью, пропорциональной числу клеток или спор, еще сохранивших жизнеспособность к данному

(анализируемому) моменту времени:

18

−d[[xo]] = k[х]

d τ

Если в начальный момент времени при τ = 0 число

жизнеспособных особей микроорганизмов составляла [хо], то ко времени τ она достигает величины:

(процесса). Так, уменьшение числа клеток в 10 раз вследствие их

равному 2,303.

На практике важной характеристикой оказывается время, за которое концентрация выживших клеток уменьшается в 10 раз.

Из уравнения (*): τ10=2,303/k.

Величина критерия стерилизации обычно задается при стерилизации жидких сред для обеспечения требуемой степени их асептики. Поэтому, зная значение удельной скорости гибели k

клеток при определенной постоянной температуре, по уравнению

(*) находят необходимую продолжительность термообработки

среды τ.

19

Гибель клеток и спор резко ускоряется с ростом температуры.

В интервале 100-140 оС удельная скорость гибели клеток k

возрастает в 104-105 раз, при повышении температуры на 10 оС

удельная скорость гибели клеток и спор возрастает в 10 раз и более.

Зависимость удельной скорости гибели клеток от температуры

Постоянную E в этом уравнении по аналогии с химической кинетикой называют энергией активации процесса гибели

микроорганизмов.

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- суспензия дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в объеме

500 мл на каждое занятие;

-микроскопы – 5 шт.;

-камера Горяева-Тома – 5 шт.;

-водяная баня (термостат) – 1-2 шт.;

-краситель (метиленовый синий);

-лабораторные стаканчики объемом 20-50 мл (по 1 шт. на бригаду)

-пробирки (5 шт. на бригаду);

-мерные цилиндры объемом 10 мл (5 шт.);

-пипетки объемом 1 или 2 мл (5 шт.);

-фильтровальная бумага;

-марлевые салфетки

20