Оценка устойчивости почв и наземных экосистем Крыма к химическому загрязнению. Монография

41

Горизонт А1(7 – 40 см) – гумусово-аккумулятивный горизонт, свежий, темно-серый со слабым каштановым оттенком, тяжелосуглинистый, зернисто-мелкокомковатый, рыхлый, густо пронизан корнями, переход по окраске постепенный, по вскипанию от HCl заметный.

Горизонт АВca (40 – 62 см) – верхний переходный, темносерый с буроватым оттенком, тяжелосуглинистый, зернистокомковатый, плотный, пористый, переход постепенный.

Горизонт В2са (62 – 80 см) – переходный, темно-бурый, тяжелосуглинистый, уплотненный, но пористый, постепенный переход.

Горизонт В3са (80 – 115 см) – иллювиально-карбонатный («белоглазка»), палево-бурый, уплотненный, комковатый, имеются темные гумусированные пятна, постепенный переход.

Горизонт Сса (115 – 200 см) – почвообразующая порода – лессовидная легкая глина, палевый, плотный, пористый, крупнокомковатый, переход постепенный.

Общая сумма водорастворимых солей достигает 4%, что характери-

зует слабую степень засоления. Доля обменных катионов в горизонте А составляет 10,6%, в горизонте АВtna – 16%, что указывает на высокую степень солонцеватости. Na – 3,3% ; Ca – 87,7%. Реакция среды сильнокислая

– pH составляет 8,5-9,1. Содержания карбоната кальция в иллювиальном горизонте не больше 8%.

Темно-каштановая почва (солонцеватая).

Зональные каштановые почвы представлены в Крыму на СевероКрымской низменности. Они образуются в плакорных условиях сухих степей под типчаково-ковыльной и полынно-типчаково-ковыльной растительностью при неустойчивом и недостаточном увлажнении, что определяет меньшее накопление гумуса, меньшую глубину промывания и вымывания

42

солевых продуктов почвообразования. Кроме того, слабому накоплению гумуса способствует континентальность климата, что влечет за собой нерегулярное промерзание и более полную минерализацию органического вещества.

Подтип темно-каштановые почвы занимают на полуострове площадь

в225 тыс. га. Их почвенный профиль характеризуется:

Горизонт А - темно-серый с каштановым оттенком, мощностью 20-30 см, пылевато-пороховато-комковатой структурой

Горизонт В1 – с гумусо-переходной мощностью в 10-15 см, темно-бурого цвета, крупно-комковатой структуры, уплотненный

Горизонт В2 – бурого цвета, неравномерно окрашенный от пятен и потеков гумуса, комковато-призматической структуры, более плотного сложения

Горизонт ВССа – иллювиально-карбонатный, мощностью 40-50

см

Содержания гумуса в горизонте А – 1,7 – 3%; в горизонте В – 50-60 см до 1%.

Гумус прочно связан с минеральной частью. Реакция среды нейтральная или слабощелочная. Так в горизонте А – слабощелочная, в горизонте В – среднещелочная до 8,3 – 8,6.

Сумма поглощенных оснований в горизонте А составляет 32-35 мгэкв на 100 г почвы. Доля обменных катионов варьирует в пределах: Са –

60-80%, Mg - 8-37%, Na - 3-10%.

Коричневая карбонатная почва.

Этот подтип коричневых почв сформировался на элювии, делювии карбонатных пород – известняков, мергелей, смешанных отложениях.

43

Подтип по площади составляет около 67% от общего распространения коричневых почв на полуострове Крым. Они характеризуются наличием во всем профиле карбонатов кальция, более слабой оглиненностью метаморфического горизонта, меньшей мощностью гумусового горизонта. Реакция среды щелочная – 7,5-8,3.

Коричневые почвы формируются в условиях предгорий и низкогорий на щебнисто-каменистых отложениях.

Бурая лесная почва.

Бурая лесная почва складывается из 3-х частных почвенных процессов: гумусо-аккумулятивного, оглинивания, лессиважа. Для них характерен коричнево-бурый цвет или чисто бурый цвет гумусового горизонта, оглиненность переходных горизонтов; накопление оксалатных и свободных форм железа в верхней части профиля, отсутствие или слабовыраженность перераспределения кремнезема и полуторных оксидов по профилю вниз.

Данный подтип почв характеризуется наличием осветленного комковатого или комковато-пороховатого горизонта А1А2, отчетливым уплотнением и увеличением мощности горизонта Вm, проявлением в нем марган- цево-железистых примазок, ореховатой структуры с заметной примазанностью. Реакция среды слабокислая.

Горно-луговая (субальпийская) почва.

Горно-луговая почва сформировалась в условиях прохладного влажного климата на элювии и делювии верхнеюрских известняков под покровом мезофитных лугов.

44

Аккумуляция гумуса протекает в автономном режиме на фоне сквозного промачивания атмосферными осадками. Их почвенный профиль характеризуется:

Горизонт Аd – дерновый; А – гумусовый, мощностью до 20 см

ссодержанием гумуса 6-10%, в составе преобладают гуминовые кислоты и их малоподвижные соединения с кальцием. Данный слой характеризуется бархатистостью, мягкокрупитчатостью иногда зернистостью, рыхлостью, он суглинистый с густым пронизыванием корнями.

Горизонт В – 15-20см – переходный, т.е. характеризуется заполнением пространства между обломками плотной породы гумусированным материалом

Горизонт ВС – нижний переходный с преобладанием свойств материнской породы

Горизонт С – элювий материнской породы

Горизонт D – представлен плотной породой

Для этой почвы характерна высокая поглотительная способность до 80 мг-экв на 100 г почвы. Реакция среды от слабокислой до слабощелочной.

45

ГЛАВА 4. МЕТОДИКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбранные почвы исследовались в рамках модельного эксперимента

влаборатории кафедры экологии и природопользовании. Методика проведения данного эксперимента разработана и изложена научным составом кафедры в справочнике по оценке почвы (Вальков и др., 1999; Казеев, Колесников, 2003).

Лабораторно-аналитические исследования выполнены с использованием общепринятых в экологии, биологии и почвоведении методов (Звягинцев, 1991; Казеев, Колесников, 2012).

Вкачестве химических загрязнителей были выбраны тяжелые металлы (ТМ) и нефть. Из ТМ исследовали Pb, Cu,Cr, Ni так как именно ими в наибольшей степени загрязнены почвы на Юге России (Дьяченко, 2004). Кроме того, данные ТМ интересны для сравнения, поскольку имеют схожую степень токсичности — их ПДК составляют 100 мг/кг почвы. Использованы значения ПДК, разработанных в Германии (Касьяненко, 1992). Это связано с тем, что ПДК в почве валовых форм меди и никеля в России отсутствуют. Кроме того, «российская» ПДК свинца зачастую не может быть использована, так как меньше содержания этого элемента во многих почвах. Не разработана ПДК в почве нефти, поэтому для выражения концентрации нефти в почве использовали ее процентное содержание.

Изучали действие разных концентраций загрязняющих веществ в почве: ТМ — 1, 10, 100 ПДК (100, 1000 и 10000 мг/кг соответственно), нефть — 1, 5, 10% от массы почвы.

Тяжелые металлы вносили в почву в форме оксидов (PbO, CuO, CrO3, NiO), поскольку загрязнение почв на 70-90% происходит преимущественно

воксидной форме (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989).

Оксиды исследованных ТМ не растворимы в воде, для того, чтоб они равномерно распределились по всему объему почвы в каждом вегетацион-

46

ном сосуде, сначала их смешивали с небольшим количеством почвы, а затем с оставшимся количеством. В каждом вегетационном сосуде было по 500г почвы.

В случае с нефтью поступали аналогично.

Для расчета массы вносимого оксида ТМ брали сумму атомных масс ТМ и кислорода в его химической формуле и производили расчет (Пример: CrO3 = 52 + (16*3) = 52 + 48 = 100, где 100мг (1ПДК) (1000мг(10ПДК),10000мг(100ПДК)) - 52, а Xмг - 100; Х=100*100/52=192,3мг или 0,192г).

Для расчета массы вносимой нефти использовали почвенную массу (500г) деленную на процентное количество (1%, 5%, 10%), т.е. 500/1=5мл; 500/5=25мл; 500/10=50 мл.

Почву инкубировали в вегетационных сосудах при комнатной температуре (20-22 С) и оптимальном увлажнении (60% от полевой влагоемкости) в трехкратной повторности.

Состояние почвы определяли через 30 суток после загрязнения. Этот срок проявил себя наиболее информативным при исследовании влияния химического загрязнения на биологические свойства почвы (Колесников и др., 2000).

В биодиагностике почв использовали следующие показатели: каталаза и дегидрогеназа, микробиологические показатели – метод обрастания почвенных комочков бактериями рода Azotobacter, целлюлозолитическая активность, численность бактерий методом люминесцентной микроскопии, фитотоксические свойства почв на примере тест-объекта – редиса (сорт «Дуро краснодарское»).

Каталаза – это фермент класса оксидоредуктаз. Это один из главных ферментов разрушения активных форм кислорода, поскольку является катализатором реакции разложения перекиси водорода, при которой образу-

47

ются вода и молекулярный кислород. Перекись водорода образуется при дыхании живых организмов и при биохимических реакциях окисления органических веществ. Эту функцию каталаза разделяет с ферментом GSHPX. Оба этих вещества лишают токсичности активный кислородный радикал, служа катализатором образования перекиси водорода из супероксида.

Каталаза имеется во всех живых организмах, кроме анаэробных бактерий. В клетках этот фермент содержится в пероксиомах. Почвы так же проявляют высокую каталазную активность.

По составу, фермент является гемопротеином простетической группы (небелковый элемент, связанный с белком) содержащий ион трехвалентного железа. Одна молекула каталазы включает четыре идентичные субъединицы и четыре простетические группы, связанные с его белковой частью.

В лабораторных условиях активность каталазы определяли газометрическим методом (метод Галстяна А.Ш.). Метод заключается в измерении скорости распада при взаимодействии с почвой по объему выделяющегося кислорода.

Сам анализ проводится с использованием прибора из двух колб соединенных друг с другом и со шлангом бюретки «штанишки». Почвенную навеску массой 1 г вносили в одну из колб, а в другую приливали 5 мл 3%- го раствора перекиси водорода. Одну колбу закрывали каучуковой пробкой, а другую пробкой со шлангом, ведущим к бюретке. После этого содержимое колб смешивали и встряхивали 1 минуту. Выделяющийся таким образом кислород вытесняя из бюретки воду, изменяет ее уровень. Активность фермента выражали в миллилитрах О2, выделяющегося за одну минуту из 1 г почвы.

Дегидрогеназа – фермент класса окидоредуктаз, катализирующий процесс отщепления двух атомов водорода от окисляемого субстрата и переноса его на другой субстрат (акцептор) которым могут быть – углеводы,

48

аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и др. Это фермент белковой природы и очень чувствителен к действию биологических ядов и иных токсикантов. Степень активности данного фермента снижается, поэтому по степени его подавления можно быстро судить о токсичности того или иного вещества.

Влаборатории проводилось определение активности дегидрогеназы, где в качестве водорода применялись бесцветные соли тетразолия (2,3,5- трифенилтетразолий хлористый (ТТХ)), который восстанавливается в оранжево-красном соединении формазанов (трифенилформазан (ТФФ)).

Анализ проводился с использованием почвенной навески в 1 г, которая помещалась в пробирку, и к ней добавлялся 1 мл 0,1М раствор глюкозы

и1 мл 1%-го раствора ТТХ. Затем пробирки помещались в эксикатор, чтоб создать анаэробные условия, эксикатор помещался в термостат на сутки для поддержания постоянной тепмературы 30 С. После инкубации в пробиркидобывляли 10 мл этилового спирта, встряхивали, цинтрифугировали для осаждения почвы и колориметрировали. Активность фермента выражали в мг ТТФ на 10 г почвы за 24 часа.

Бактерии р. Azotobacter – род почвенных бактерий способных в результате азотфиксации переводить газообразный азот в растворимую форму, доступную для усваивания растениями. Этот род бактерий грамотрицательный. Спор не образует.

Вмолодом состоянии клетки бактерий свободноживущие, по мере старения они образуют симбиоз с корнями некоторых растений, тем самым создавая ризосферу. Они имеют полный набор ферментов для азотфиксации – ферредоксины, гидрогеназы, нитрогеназы, каталазы, оксидазы.

Кроме того, этот род использует различные углеводы, спирты, соли органических кислот в качестве источника углерода, а значит и энергии. В

49

качестве источника азота они используют нитраты, ионы аммония и аминокислоты.

Вкруговороте азота почвы рода Azotobacter играет большую роль. Так же они синтезируют биологически активные вещества, куда относятся фитогормоны. Человеком данные бактерии используются в сельском хозяйстве для получения азотных удобрений (азотобактерина). Кроме того, являясь продуцентами альгиновой кислоты, они используются в медицине.

Вэкологическом значении представители рода, благодаря мобилизации ТМ в почве (Cd, Hr, Pb) участвуют в ее самоочищении. Некоторые представители рода способны к биодеградации хлорсодержащих ароматических соединений, которые могут входить в состав инсектицидов, фунгицидов и гербицидов, но оказывающие мутагенное и канцерогенное действие.

Вданной работе исследовался метод обрастания почвенных комочков бактериями р. Azotobacter. Бактерии высаживались на питательную среду Эшби, которая является безазотистой и предназначена специально для выделения свободноживущих азотфиктирующих и олигонитрофильных организмов. В качестве источника углерода в среде выступает манит и сахароза, а так же набор микроэлементов содержащих серу.

На такой плотной среде бактерии образовывали плоские и слизистые колонии, диаметром 5-10 мм. По интенсивности обрастания почвенных комочков судили о степени ингибирования бактерий различными токсикантами.

Подсчет бактерий методом люминесцентной микроскопии – этот метод основан на оптическом исследовании микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), которые испускают свечение при воздействии ультрафиолетовых лучей. В нашем случае использовался для окрашивания краситель акридиновый оранжевый. Использование

50

именно этого красителя позволяет выявить нуклеиновые кислоты, где ДНК дает зеленую окраску, а РНК – красную, мукополисахаридов, для обнаружения микробов, распознавание раковых клеток и даже вирусов.

Для наших целей использование акридинового оранжевого необходимо было для обнаружения почвенных бактерий (преимущественно палочек и кокков) за счет высокого контраста – яркое свечение исследуемых объектов на темном фоне.

Для анализа была приготовлена почвенная суспензия в соотношении 1:10. Данную суспензию встряхивали в течение 20 минут, после чего отбирали небольшое ее количество и распределяли на обезжиренном предметном стекле на площади 2х2 см. на одном таком препарате использовали 2 повторности одного образца. После чего, суспензию фиксировали над пламенем горелки и помещали в разведенный краситель акридиновый оранжевый на 20-25 минут. После этого препарат извлекался, промывался водопроводной водой и высушивался при комнатной температуре. Для микроскопии на препарат наносилась капля воды и покрывалась обезжиренным покровным стеклом. Микроскопирование осуществлялось на микроскопе

HBO 100 Microscope Illuminating System (Zeiss). Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы разведенной в 100мл дистиллированной воды, вычисляли по формуле: М = 4 * а/ 15,9 * 108, где М – количество клеток в 1г почвы; а – среднее число клеток в поле зрения, 15,9 – площадь поля зрения (мкм2).

Целлюлозолитическая активность – по своей природе целлюлоза является полисахаридом, линейным полимером, состоящим из цепочек молекул бета-D-глюкозы соединенных бета-1,4-гликозидными связями. Цепочки моносахаридов объединены в волокна, окруженные оболочкой, в состав которой входит пектин. Данное химическое строение делает ее весьма ус-