Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

Министерство образования и науки Российской Федерации Уральский федеральный университет

имени первого Президента России Б. Н. Ельцина

Г. С. Сакович, М. А. Безматерных

МИКРОБИОЛОГИЯ

ЧАСТЬ II

Рекомендовано методическим советом УрФУ в качестве

учебно-методического пособия для студентов, обучающихся по направлению подготовки 240700 – Биотехнология

и 241000 – Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии

Екатеринбург Издательство Уральского университета

2013

УДК 576.8(075.8) ББК 22.3я7

С15

Рецензенты: кафедра фармации УГМА (зав. кафедрой, проф., д-р фарм. наук А. Ю. Петров); д-р хим. наук Д. Н. Кожевников (ИОС УрО РАН)

Научный редактор – доц., канд. хим. наук И. С. Селезнева

Сакович, Г. С.

С15 МИКРОБИОЛОГИЯ : учебно-методическое пособие : в 2 ч. / Г. С. Сакович, М. А. Безматерных. – Екатеринбург: Изд-во Урал.

ун-та, 2013. – Ч. II. – 92 с. ISBN 978-5-7996-0853-8 (ч. II) ISBN 978-5-7996-0851-4

Учебно-методическое пособие по дисциплинам «Общая биология и микробиология», «Основы микробиологии и биотехнологии», «Методы получения промышленных штаммов микроорганизмов», «Основы асептики микробиологических производств», «Культивирование промышленных штаммов микроорганизмов», «Микробиологические аспекты биотехнологических производств» предназначено для студентов всех форм обучения по направлениям подготовки бакалавриата и магистратуры 240700 – Биотехнология и 241000 – Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии. Часть II пособия включает 11 занятий курса (с 8 по 18) и указания к проведению практических работ с изложением основных сведений об объектах исследования.

Библиогр.: 11 назв. Рис. 7.

УДК 576.8(075.8) ББК 22.3я7

ISBN 978-5-7996-0853-8 (ч. II) © Уральский федеральный университет, 2013

ISBN 978-5-7996-0851-4

ОГЛАВЛЕНИЕ

ТЕМА III. СТАНДАРТНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕ-

СКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУБСТРАТОВ:

ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА И ДРУГИХ ОБЪЕКТОВ…………………….4

Занятие 8. Количественный учет микроорганизмов на твердых средах методом счета колоний………………………………………………………..4

Занятие 9. Количественный и качественный анализ микрофлоры есте-

ственных объектов. Выделение чистых культур бактерий………………..14

Тема IV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ….................................23

Занятие 10. Определение чистоты бактерий неизвестного вида. Посев на дифференциально-диагностические среды………………………………….23

Занятие 11. Идентификация бактерий……………………………………….27

ТЕМА V. БИОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ.

ЭЛЕКТИВНЫЕ (НАКОПИТЕЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ)………………………30

Занятие 12. Изучение методов получения накопительных культур для выделения микроорганизмов разных физиологических групп……………30

Занятие 13. Количественный учет микроорганизмов прямым счетом на фиксированных мазках. Анализ элективных культур……………………...40

ТЕМА VI. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ЖИЗНЕДЕЯ-

ТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ………………………………………50

Занятие 14. Методы жизнедеятельности вредных для человека микробов.50

Занятие 15. Анализ антимикробного действия факторов внешней среды..61

Занятие 16. Количественный учет микроорганизмов методом непосред-

ственного (прямого) счета под микроскопом с помощью счетных камер..68

Занятия 17-18. Допустимые нормы содержания микроорганизмов в раз-

личных медицинских препаратах. Методы определения микробной загряз-

ненности лекарственного сырья и лекарственных форм………………….73

ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………85

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК……………………………………….91

3

Тема III. СТАНДАРТНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУБСТРАТОВ:

ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА И ДРУГИХ ОБЪЕКТОВ

Занятие 8. Количественный учет микроорганизмов на твердых средах методом счета колоний

Цель занятия – освоение количественного метода учета микроорга-

низмов путем счета колоний.

Вопросы для обсуждения:

1.Существующие методы учета микроорганизмов.

2.Понятие «микробное число».

3.Понятие «санитарно-показательные микроорганизмы».

4.Отбор почвенных образцов.

5.Отбор пробы при исследовании обсемененности микроорганизмами поверхности объекта.

6.Отбор пробы при исследовании обсемененности рук.

7.Определение количества микроорганизмов в воздухе.

8.Сущность метода счета колоний; среды, применяемые в этом методе для выращивания бактерий, дрожжей и плесеней.

9.Достоинства и недостатки метода счета колоний при оценке микробной обсемененности объекта.

План занятия:

1. Ознакомиться с методами количественного учета микроорганизмов,

способами «взятия средней» пробы.

2. Ознакомиться с методами определения общего количества микроорга-

низмов (микробного числа) в различных объектах.

4

3. Самостоятельная работа: постановка задач по количественному учету

микроорганизмов в пробах почвы, воздуха, смыва с рук и с поверхности

рабочих столов.

Характеристики обсеменения окружающей среды микроорганизмами

Микроорганизмы распространены в природе повсеместно: в почве,

водоемах, на различных поверхностях, в теле человека и животных. Одним из наиболее благоприятных субстратов для развития самых разнообразных микроорганизмов является почва. Из почвы микроорганизмы попадают в воздух. В воздух и воду попадают микроорганизмы из тела человека и жи-

вотных. Почва, вода, воздух могут служить источником микробного за-

грязнения пищевых продуктов, лекарственного сырья и препаратов, произ-

водственных помещений, а также источником заражения людей патоген-

ными микроорганизмами. Однако определение в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов затруднено, так как они пребывают там временно и содержатся в небольших количествах, а методы их выяв-

ления длительны и трудоемки. Поэтому для характеристики обсеменения окружающей среды микроорганизмами определяют микробное число и со-

держание санитарно-показательных микроорганизмов.

Микробное число – это общее содержание микроорганизмов в едини-

це веса или объема исследуемого объекта (1 г почвы, 1 мл Н2О, 1 м3 воз-

духа).

Санитарно-показательные микроорганизмы – это микроорганизмы,

которые постоянно содержатся в выделениях человека и некоторых тепло-

кровных животных; не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания; после выделения в окружаю-

щую среду сохраняются жизнеспособными в течение сроков, близких к срокам выживания некоторых патогенных бактерий, выделяющихся из ор-

ганизма теми же путями; не могут интенсивно размножаться в окружаю-

5

щей среде, т. е. их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду, легко обнаруживаются современными микробиологическими методами и поддаются количе-

ственному определению; являются достаточно типичными для дифферен-

циации от других видов и достаточно стабильными по своим признакам.

Основными санитарно-показательными микроорганизмами для раз-

ных объектов окружающей среды являются следующие: E. coli, S. faecalis –

для воды, E. сoli, S. faecalis, C. perfringens – для почвы, S. haemolyticus, S. viridans, S. аureus – для воздуха, E. coli, S. faecalis, S. аureus – для предме-

тов обихода.

Для количественной характеристики микробной загрязненности поч-

вы, воды и других объектов наиболее часто употребляют показатели: коли-

титр, коли-индекс и перфрингенс-титр.

Коли-титр – это наименьшее количество исследуемого материала, в

котором обнаруживается жизнеспособная E. coli, коли-титр выражается в миллилитрах для воды и в граммах для твердого материала.

Коли-индекс – количество клеток кишечной палочки в 1 л воды или. 1 г почвы.

Санитарная оценка показателя: присутствие в объекте повышенного количества бактерий группы кишечной палочки свидетельствует о неудо-

влетворительном санитарном состоянии объекта.

Существует два основных, принципиально различных метода коли-

чественного учета микроорганизмов в исследуемом объекте: прямой под-

счет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках, на мембранных фильтрах) и путем культивирования на питательных средах. На плотных средах – чашечный метод Коха, на жидких средах – метод предельных разведений или метод титра. Методы прямого счета клеток под микроскопом дают возможность учесть числен-

ность, микроорганизмов в субстрате наиболее полно. Однако при этом

6

определяются чаще всего живые и мертвые клетки. Кроме того, одно толь-

ко наблюдение микроорганизмов под микроскопом не позволяет судить о том, какие процессы проводят они в данном субстрате.

Методами высева на плотные и в жидкие питательные среды учиты-

ваются только жизнеспособные клетки микроорганизмов. Если хотят вы-

делить и учесть как можно более широкий круг микроорганизмов, населя-

ющих данный субстрат, используют метод Коха и при этом подбирают та-

кую по составу среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными свойствами. Но поскольку не существует универсальных пи-

тательных сред и условий выращивания, пригодных для всех видов микро-

организмов, метод высева дает возможность определить наличие на суб-

страте только тех микроорганизмов, которые способны расти на данных средах и в данных условиях.

Для выявления санитарно-показательных микроорганизмов исполь-

зуют элективные среды.

Содержание микроорганизмов и их видовой состав в разных участ-

ках исследуемого объекта могут быть неодинаковыми, поэтому для анали-

за отбирают среднюю пробу. Средняя проба – это сравнительно небольшое количество исследуемого объекта, взятое так, что степень обсемененности его микроорганизмами соответствует среднему количеству их в единице веса или объема объекта. При взятии средней пробы необходимо соблю-

дать условия, исключающие загрязнение исследуемого объекта посторон-

ними микроорганизмами.

Количественный учет микроорганизмов путем счета

колоний (чашечный метод Коха)

Этот метод является наиболее распространенным для определения общей микробной обсемененности различных субстратов. Сущность ча-

шечного метода заключается в том, что производят посев определенного

7

объема исследуемого материала в чашки Петри с плотной питательной средой. При последующем выращивании посева в термостате из каждой клетки в результате размножения образуется колония; количество их под-

считывают.

В качестве питательной среды для учета бактерий применяют мясо-

пептонный агар, для подсчета плесневых грибов и дрожжей – сусло-агар.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений,

посев на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших

колоний.

Приготовление разведений. Количество микроорганизмов в объектах внешней среды, как правило, велико, поэтому для получения отдельных

колоний готовят ряд разведений исследуемого вещества.

Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиоло-

гическом растворе (0,5%-ый водный раствор NаСl), обычно пользуются

десятикратными последовательными разведениями (1:10, 1:100,

1:1000 и т. д.).

При исследовании продукта твердой консистенции на технических

весах отвесить с помощью часового стекла и стерильного скальпеля пробу продукта (1– 10 г), перенести в стерильную ступку и растереть в однород-

ную массу, добавляя стерильный кварцевый песок. Полученную навеску количественно и асептически перенести в колбу со 100 мл стерильного фи-

зиологического раствора – получится первоее разведение (1:100). Суспен-

зию в колбе тщательно взболтать в течение 3– 5 мин, стерильной пипеткой взять 1 мл полученной суспензии и перенести в пробирку с 9 мл стериль-

ного раствора NaCl. Это второе разведение (1:103). Суспензию этого разве-

дения перемешивают с помощью другой стерильной пипетки, вбирая и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3– 5 раз,

что обеспечивает перемешивание суспензий и уменьшает адсорбцию кле-

ток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл этой взвеси и

8

переносят ее во вторую пробирку – это разведение 1:104. Таким образом готовят и последующие разведения.

Степень разведения исследуемого образца определяется предполагае-

мым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном суб-

страте (рис.1).

Рис. 1 . Схема приготовления разведений суспензии микроорганизмов и посева

Для приготовления каждого разведения обязательно используют от-

дельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к полу-

чению ошибочного результата, иногда в 1000 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пи-

петки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приго-

товлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стен-

ках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

Посев на агаризованные среды в чашки Петри для поверхностного роста. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду по 20–30 мл в каждую. Чашки остав-

ляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2–3 суток при 30 °С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посе-

ва отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда исполь-

9

зуют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, тре-

бующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре по-

сле застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предпо-

лагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Сте-

рильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05, 0,1 или

0,2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно переме-

шанного, на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. При выявлении микроорганизмов, количество кото-

рых в субстрате относительно невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке Петри.

Из каждого разведения делают, таким образом, 4–6 параллельных высевов. Для параллельных рассевов из одного разведения можно пользо-

ваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из раз-

ных разведений, используют новую стерильную пипетку и новый шпатель.

Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов, перевернув их вверх дном.

Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные количества плотной среды, заготовленные в пробирках по 10–15 мл. Куль-

туру вносят в пробирки с расплавленным и охлажденным до 40–45 °С ага-

ром, а затем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем зали-

вают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тща-

тельно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара.

10