Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

Например, при подсчете взвеси дрожжей в камере Горяева обнару-

жено 15 дрожжевых клеток в одном малом квадрате. Густая взвесь была предварительно разведена 1 : 100:

M = 151000 400100 = 60108. 0,1

В практике микробиологических исследований нередко достаточно приблизительной оценки степени обсемененности продукта микроорга-

низмами. В таких случаях, например при исследовании мяса и рыбы, про-

водится прямое микроскопирование (бактериоскопия) продукта или приго-

товленного из него высушенного и окрашенного препарата. О степени об-

семененности продукта микроорганизмами судят по их количеству в поле зрения микроскопического препарата. Микроскопирование позволяет установить характер микрофлоры (бактерии, дрожжи, плесени), соотноше-

ние между отдельными группами бактерий (кокки, палочки).

Микроскопические исследования широко применяются при оценке качества различных кисломолочных продуктов, пищевого уксуса, пива,

прессованных хлебопекарных дрожжей. Эти исследования дают возмож-

ность выявить инфицирование продуктов посторонними микроорганизма-

ми, не свойственными микрофлоре данных продуктов.

Преимущество прямых методов заключается в возможности сравни-

тельно быстрого проведения количественного и качественного микробио-

логического исследования. Однако эти методы имеют существенный недо-

статок: при очень малом числе микробных клеток в исследуемом субстрате невозможно получить точные результаты. Кроме того, при подсчете бакте-

рий невозможно установить принадлежность их к той или иной физиоло-

гической группе, а при применении общепринятого метода Виноградского

(метод счета на фиксированных мазках) отличить живые клетки от мерт-

вых.

71

Методические указания

1.Приготовить 0,1%-ю суспензию прессованных дрожжей. Отвесить на обожженном часовом стекле 0,1–0,5 г дрожжей. Тщательно растереть навеску в ступке с 1–2 мл водопроводной воды в жидкую кашицу и слить

еев мерную колбу объемом 100–500 мл в зависимости от взятой навески дрожжей. Ступку ополоснуть водой, которую слить в ту же колбу. Колбу долить водопроводной водой до метки.

2.Полученную суспензию взбалтывать в течение 5 мин и небольшое количество ее отлить в стаканчик. Помешивая стеклянной палочкой, взять

1–2 капли дрожжевой суспензии и нанести на сетку счетной камеры,

накрыть покровным стеклом, притерев его осторожно пальцем к боковым пластинкам. Жидкость под покровным стеклом должна растечься по всей сетке. Следить, чтобы не было пузырьков воздуха.

3. Камеру поместить на предметный столик микроскопа и с объекти-

вом 8 найти сетку. Не передвигая ее, заменить объектив 8 на объектив 40.

После нескольких минут стояния камеры, когда дрожжи осядут на ее дно (на сетку), подсчитать количество их в пяти больших квадратах, а если это невозможно (клеток слишком много), то подсчитать в 80 малых квад-

ратах, передвигая камеру так, чтобы одно и то же место не попало в поле зрения микроскопа несколько раз. В том случае, когда клетки находятся на пограничных линиях, их считают только на двух смежных границах квад-

рата, например, на верхней и правой.

После окончания работы счетную камеру и покровное стекло хоро-

шо промыть водой, протереть и убрать в футляр.

4. Найти среднее число клеток для одного малого квадрата (т. е. в

1/4000 мм3 суспензии) или одного большого квадрата (1/250 мм3 суспензии).

При умножении найденного среднего числа на 4000 (в случае подсчета в малом квадрате) или на 250 (при подсчете в большом квадрате) получаем число дрожжевых клеток в 1 мм3 исследуемой суспензии. Умножив полу-

72

ченное число на 1000, получаем число дрожжевых клеток в 1см3 испытуе-

мой суспензии.

Количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных дрожжей опреде-

лить по формуле:

где Х – искомое число дрожжевых клеток в 1 г прессованных дрожжей;

а – количество дрожжевых клеток в 1 см3 дрожжевой суспензии;

б – объем мерной колбы, см3;

в– навеска прессованных дрожжей, г.

5.Для определения процентного содержания мертвых клеток в прес-

сованных дрожжах взять каплю тщательно перемешанной суспензии дрожжей на предметное стекло, добавить к ней маленькую каплю раствора метиленовой сини и накрыть покровным стеклом. Через 1-2 мин микро-

скопировать препарат с объективом 40х и подсчитать число окрашенных и неокрашенных клеток в 10 полях зрения. Окрашенные клетки являются мертвыми.

6. Оформить протокол исследования.

Занятия 17-18. Допустимые нормы содержания микроорганизмов в различных медицинских препаратах.

Методы определения микробной загрязненности лекарственного сырья и лекарственных форм

Цель занятий: ознакомиться с источниками микробного загрязнения лекарственного сырья и лекарственных форм и мерами предупреждения их микробной загрязненности; освоить методы микробиологического кон-

троля загрязненности лекарственного сырья.

73

Вопросы для обсуждения:

1.Источники микробного загрязнения лекарственного сырья и лекарствен-

ных средств.

2.Меры предупреждения микробной загрязненности лекарственных средств.

3.Методы микробиологического контроля загрязненности лекарственных средств.

План занятия:

1.Ознакомление с источниками микробного загрязнения лекарственного сырья и лекарственных форм и мерами предупреждения их микробного загрязнения.

2.Самостоятельная работа – освоение методов микробиологического кон-

троля загрязненности лекарственных средств.

Пояснение к занятию

Лекарственное сырье и готовые лекарственные формы могут содер-

жать значительное количество разнообразных микроорганизмов. Загряз-

ненность растительного лекарственного сырья зависит от условий произ-

растания и вида растения.

Растения могут быть загрязнены микроорганизмами из окружающей среды и особенно из почвы. Кроме того, большое значение имеет микро-

флора самих растений как эпифитная (Erwinis herbicola, P. fluorescens и

др.), так и фитопатогенная (родов Erwinis, Pseudomonas, актиномицеты,

некоторые грибы).

Растительное лекарственное сырье может обсеменяться на всех эта-

пах его заготовки и хранения: сбора, первичной обработки, сушки, измель-

чения, упаковки, а также при его приведении в стандартное состояние по-

лучение резаного сырья, растительных порошков, брикетов, гранул, табле-

ток.

74

Порча сырья происходит прежде всего при повышении влажности,

которая стимулирует размножение грибов, гнилостных, целлюлозоразру-

шающих бактерий и др. Микробная деградация приводит к изменению фармакологических свойств растений и может служить причиной образо-

вания токсичных продуктов. Загрязняя лекарственные препараты, микро-

организмы могут изменять свойства лекарств, делая их неактивными или даже токсичными, благодаря ферментным превращениям лекарственного вещества или образованию микробных токсинов и пирогенов.

Микрофлора готовых лекарственных форм, в свою очередь, зависит от ряда причин:

1) вида сырья, его питательной ценности для микроорганизмов или,

напротив, антимикробной активности, начальной загрязненности;

2)химической природы веществ, входящих в состав лекарственного средства;

3)технологии приготовления (таблетирования, дражирования, темпера-

туры, времени и т. д.);

4)условий хранения;

5)санитарно-гигиенических условий в цехе.

Микроорганизмы могут попадать в лекарственные средства различ-

ными путями: из сырья, включая воду, воздуха, рук персонала, аппарату-

ры. Для предупреждения возможности загрязнения лекарственных средств необходимо соблюдать следующие правила:

1)использовать сырье, не поврежденное микроорганизмами;

2)правильно хранить лекарственное сырье и готовые лекарственные формы, соблюдая необходимые режимы влажности, температуры и гигиены;

3)соблюдать условия приготовления лекарств, исключающие попада-

ние микроорганизмов извне (дезинфицировать помещение, использовать

стерильное оборудование и т. д.);

75

4)соблюдать личную гигиену;

5)упаковка лекарственных средств должна быть надежной, не допус-

кающей их загрязнения при многократном использовании; 6) если лекарственная форма, предназначенная для многократного ис-

пользования, содержит вещества, легко поражаемые бактериями (сахара,

белковые вещества), к ней должен быть добавлен консервант.

Признаками микробной порчи жидких лекарственных форм является помутнение, если лекарственная форма должна быть прозрачной, появле-

ние осадка, увеличивающегося в объеме, образование пленки на поверхно-

сти, а также появление запаха, несвойственного данной лекарственной форме.

Присутствие микроорганизмов в твердых лекарственных средствах и некоторых жидких удается определить только путем микробиологического анализа. Микробную загрязненность препаратов выражают количеством клеток микроорганизмов в 1 г сухого препарата или в 1 мл раствора. При определении микробной загрязненности следует учитывать, что лекар-

ственное вещество может обладать антимикробным действием. Это дей-

ствие бывает бактериостатическим и бактерицидным. Сами же микроорга-

низмы по отношению к лекарственному веществу могут быть чувстви-

тельными или устойчивыми. Все это осложняет методику определения микробной загрязненности и требует индивидуального подхода к конкрет-

ной лекарственной форме.

Имеются определенные требования ВОЗ и фармакопеи, ограничива-

ющие микробную загрязненность неинъекционных препаратов. Несте-

рильные лекарственные формы для приема per os не должны содержать патогенную и условно патогенную микрофлоры. Лекарственные формы для местного, интравагинального применения, для применения в полости уха, носа не должны содержать более 100 микробных клеток в 1 г (мл)

препарата. Для прочих лекарственных форм число сапрофитных бактерий

76

не должно превышать 1000 клеток, а патогенных грибов – 100 клеток в 1 г

препарата.

Перед определением микробной загрязненности лекарственных средств следует определить их антимикробное действие.

Самостоятельная работа

1.Определение микробной загрязненности растительного лекарственного сырья.

2.Определение антимикробного действия лекарственного средства.

3.Определение микробной загрязненности лекарственных средств, не об-

ладающих антимикробным действием.

4.Определение микробной загрязненности лекарственных средств, обла-

дающих антимикробным действием.

Задача 1. Определение микробной загрязненности

растительного лекарственного сырья

В асептических условиях, используя стерильные инструменты, взве-

сить 1 г сырья, поместить в стерильную пробирку с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и встряхивать в течение 10 мин; взять 1 мл смыва и сделать разведение 1:10 и 1:100; из каждого разведения сделать посев

1 мл в глубину питательной среды в чашках Петри (или 0,1 мл размазать по поверхности застывшей питательной среды). Выявление роста грибов и дрожжей ведут на сусло-агаре, бактерий – на МПА, засевая по 2–3 парал-

лельные чашки на каждое разведение.

После инкубации в термостате (24 °С – для грибов и дрожжей, 37 °С – для бактерий) подсчитать количество выросших колоний и, зная разведение смыва, подсчитать микробную загрязненность сырья (на 1 г).

Оформить протокол исследования.

77

Задача 2. Определение антимикробного действия

лекарственных средств

Антибиотики, сульфаниламиды, производные хиноксалина, 8-окси-

хинолина, нитрофурана и другие обладают выраженным антимикробным действием. Помимо этого, существует ряд лекарственных средств или кон-

сервантов, оказывающих ингибирующее действие на рост и размножение микроорганизмов: кислоты, щелочи, спирты, галогены, окислители, соли тяжелых металлов; препараты, содержащие серу, фитонциды и др.

Чтобы избежать неправильных результатов, обусловленных анти-

микробным действием, которым может обладать испытуемый препарат,

при изучении его микробной загрязненности необходимо предварительно определить антимикробные свойства препарата на всех используемых для изучения тест-микробах. Для этого культуры микроорганизмов высевают на соответствующие питательные среды и вносят исследуемый препарат.

Если по сравнению с контролем наблюдают подавление роста тест-

организма, то делают заключение о наличии антимикробного действия препарата.

Постановка опыта:

1. Тест-культуры B. cereus и C. albicans, питательные среды – МПА с

1 % глюкозы, среда Сабуро с антибиотиками соответственно. В пробирки с

4 мл питательных сред, расплавленных и охлажденных до 45–50° С (по 4

пробирки с каждой средой), вносят по 0,1 мл бульонной культуры тест-

организма, разведенной 1:1000. В половину пробирок с каждой средой до-

бавляют по 1 мл стандартного фосфатного буфера рН 7,0 (контроль). В

другую половину пробирок вносят по 1 мл препарата, разведенного 1:10 в

том же буфере. Быстро перемешивают и выливают содержимое пробирок в чашки Петри с 15–20 мл той же питательной среды, предварительно разли-

той и застывшей. Равномерно распределяют верхний слой агара и дают ему застыть. Инкубируют при 37 °С 5 суток. Результаты сравнивают.

78

2. Тест-культуры E. сoli, P. aeruginosа, S. aureus.

В пробирки с 10 мл накопительной среды (по 4 пробирки с каждой средой) вносят по 0,1 мл суточной бульонной тест-культуры, разведенной

1:1000. В одну половину пробирок вносят по 1 мл стерильной воды, в дру-

гую половину – по 1 г (мл) исследуемого препарата. Далее проводят ис-

следование с применением дифференциально-диагностических сред, как это указано ниже.

Задача 3. Определение микробной загрязненности лекарственных сред,

не обладающих антимикробным действием

Отбор проб. От каждой серии препарата (независимо от ее объема)

отбирают пробу не менее чем 50 г или 50 мл, состоящую из 10 равных проб, взятых не менее чем из 10 разных упаковок. При анализе препарата используют 30 г образца, разделенного на 3 части по 10 г.

Приготовление образца для анализа. 10 г или 10 мл препарата разво-

дят стерильно 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0 или соответствующей пи-

тательной средой, доводя конечный объем до 100 мл. При разведении мяг-

ких лекарственных форм приготавливают эмульсию препарата. С этой це-

лью 10 г препарата, 10 г твина-80 и 80 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0

вносят в колбу со стеклянными бусами (разведение 1:10). Твин-80 и бу-

ферный раствор перед употреблением нагревают до 40-45° С. Колбу встряхивают 5 мин на водяной бане при 40-45°С до получения гомогенной эмульсии.

Питательные среды. МПА с 0,1 % глюкозы; агар Сабуро с антибио-

тиками (100 мг бензилпенициллина или 50 мг левомицетина на 1000 мл среды); среды обогащения для бактерий семейства Enterobacteriacese; агар Эндо, висмут-сульфитный агар; среда с феноловым красным для иденти-

фикации бактерий семейства Enterobacteriacese; среда с нитратом калия;

среда обогащения для P. aeruginosа, S. aureus; среда для выявления пиг-

79

мента P. аeruginosа; солевой агар с маннитом для идентификации S. aureus.

При испытании на микробную загрязненность лекарственных средств определяют общее количество бактерий, количество дрожжевых и плесневых грибов, наличие бактерий Enterobacteriacese видов:

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginose.

Определение общего количества бактерий. 1 мл препарата, разве-

денного 1:10, вносят в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45–50° С МПА с 0,1%-м раствором глюкозы. Быстро пе-

ремешивают и выливают в каждую из двух чашек Петри с 15–20 мл этой же среды, предварительно разлитой и застывшей. Быстрым покачиванием чашки равномерно распределяют верхний слой и дают ему застыть. Чашки инкубируют при 37 °С 5 суток. Затем подсчитывают число бактериальных колоний, находят среднее арифметическое для двух чашек и высчитывают количество бактерий в 1 г (мл) образца. Для получения достоверных пока-

зателей учитывают только те чашки, на которых выросло менее 300 коло-

ний. Если число колоний больше, делают ряд дальнейших последователь-

ных разведений (1:100, 1:1000 и т.д.), выбирая для посева наиболее подхо-

дящее разведение.

Определение общего количества грибов. Испытание проводят двух-

слойным агаровым методом, описанным выше, используя среду Сабуро с антибиотиками. Посевы инкубируют при 24 °С 5 суток.

Определение бактерий семейства Enterobacteriacese. 10 г (мл) об-

разца вносят в 90 мл среды обогащения для бактерий семейства

Enterobacteriacese, перемешивают и инкубируют при 37 °С 24–48 ч. При наличии роста делают пересевы петлей на среду Эндо и висмут-

сульфитный агар. Инкубируют при 37 °С 24–48 ч. На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriacese образуют крупные малиновые колонии с ме-

таллическим блеском или без блеска; розовые, бесцветные, блестящие, вы-

80