Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

9.Каковы свойства и значение гнилостных микроорганизмов? Какие про-

дукты распада белка образуются при их развитии?

10.Признаки, характерные для накопления сенной палочки.

11.Морфологические и культуральные признаки картофельной палочки.

12.Тип питания и дыхания картофельной палочки.

13.Питательная среда для культивирования картофельной палочки.

14.Значение добавки мела в среду для культивирования картофельной па-

лочки.

15.Условия, позволяющие получить элективную культуру картофельной палочки.

16.Какова форма клеток протея? Обладает ли он способностью к движе-

нию и спорообразованию.

17.Каков тип питания и дыхания у протея?

18.Какова оптимальная температура развития протея?

19.Почему надо иметь для опыта свежеприготовленный "скошенный" мя-

со-пептонный агар?

20.Как установить накопление протея?

21.Какие условия постановки опыта способствуют накоплению в среде протея и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?

22.Каково отношение дрожжей к рН среды?

23.Тип дыхания и тип питания дрожжей.

24.Спиртовое брожение и его биологическое значение для дрожжей.

25.Способы обнаружения продуктов жизнедеятельности дрожжей.

26.Условия опыта, способствующие получению элективной культуры дрожжей.

27.Практическое использование дрожжей.

28.Роль дрожжей в процессах порчи пищевых продуктов.

29.Каковы свойства и значение галофильных микроорганизмов?

41

30.Какие условия постановки опыта позволяют получить элективную культуру галофилов?

31.Какую форму клеток имеют галофильные бактерии?

32.Методы определения общего количества микроорганизмов путем пря-

мого подсчета клеток в фиксированных мазках под микроскопом. Пре-

имущества перед методом Коха.

Пояснения к занятию

Занятие является продолжением предыдущего по получению и изу-

чению элективных культур микроорганизмов. Попутно осваивается другой распространенный метод количественного учета микроорганизмов – пря-

мой подсчет клеток микроорганизмов в фиксированных мазках под микро-

скопом.

Метод определения общего количества микроорганизмов.

Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом по Виноградскому

Метод сводится к тому, что в определённом объеме исследуемой суспензии непосредственно под микроскопом подсчитывают количество клеток микроорганизмов. Использование фиксированных мазков дает воз-

можность сохранять препараты длительный срок и проводить подсчет не по ходу опыта, а в другое, удобное для исследования время.

Приготовление препарата. Строго определенный объем исследуе-

мой суспензии (0,02–0,05 мл) наносят микропипеткой на хорошо обезжи-

ренное, сухое предметное стекло, помещенное на миллиметровую бумагу с очерченной площадью в 6 или 4 см2, быстро распределяют по этой площа-

ди. Мазок обрабатывают по методике фиксированного окрашенного пре-

парата.

Подсчет клеток микроорганизмов проводят с иммерсионным объек-

тивом в квадратах окулярной сетки, которую вставляют в окуляр. При от-

сутствии окулярной сетки можно подсчитывать клетки микроорганизмов

42

на всей площади поля зрения микроскопа. Просчитывают 50-100 квадратов сетки (не менее 10 полей зрения), передвигая препарат по диагонали мазка.

Необходимо насчитать не менее 600 клеток бактерий. Площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) определяют с помощью объективного мик-

рометра (см. определение размера бактерий). Объект-микрометр помеща-

ют на столик микроскопа вместо препарата и при этом же увеличении микроскопа, при котором проводили подсчет клеток, измеряют сторону квадрата сетки (или диаметр поля зрения). Зная сторону квадрата сетки,

вычисляют ее площадь S. Площадь поля зрения вычисляют по формуле s = πr2. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исходной суспензии, вычисляют по формуле:

M = a · S ·n , s · V

где M – количество клеток в 1 мл исходной суспензии; a – среднее число клеток в поле зрения;

V – объем нанесенной на стекло суспензии клеток в мл;

S – площадь мазка в мкм2 (4·108 или 6·108); s – площадь поля зрения в мкм2;

n – разведение исходной суспензии.

Анализ элективных культур

Уксуснокислая палочка

Признаками накопления уксуснокислых бактерий является образова-

ние пленки на поверхности пива или помутнения и осадка и наличие в пи-

ве уксусной кислоты, являющейся продуктом их жизнедеятельности.

Самостоятельная работа

1.Изучение культуральных свойств бактерий.

2.Изучение морфологических свойств бактерий.

43

3.Обнаружение уксусной кислоты – продукта жизнедеятельности бактерий.

4.Оформление протокола исследования.

Методические указания

1. Культуральные свойства. При осмотре посева видна пленка на поверх-

ности пива или помутнение и осадок.

2. Морфологические свойства. Определяются микроскопированием сбро-

женного пива (после его взбалтывания) из обеих колбочек. Для определе-

ния формы преобладающих клеток, наличия или отсутствия спор готовят фиксированный препарат, окрашенный простым способом. Отмечают,

присутствуют ли дрожжи и как велико их число. Подвижность определяет-

ся в препарате «раздавленная капля».

3. Для обнаружения уксусной кислоты, образовавшейся в результате бро-

жения, провести качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого в пробирку налить 2 мл пива из колбочки, в которой при постановке опыта пиво не подкисляли уксусной кислотой, добавить 4 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 10 % раствора соды, 1 мл раствора хлорного железа и смесь нагреть. Темно-красное окрашивание жидкости образуется за счет уксус-

нокислого железа.

4. Сопоставить результаты микроскопического исследования препара-

тов пива из обеих колбочек, сравнить признаки обнаруженных бактерий с признаками уксуснокислых, зарисовать преобладающие микроорганизмы.

Гнилостные бактерии

Сенная палочка

Признаками накопления сенной палочки являются образование хрупкой пленки на поверхности среды, наличие в пленке коротких палочек с центрально расположенной спорой, подвижность клеток.

44

Самостоятельная работа

1.Изучение культуральных свойств бактерий.

2.Изучение морфологических свойств бактерий.

3.Подсчет числа клеток по Виноградскому.

4.Оформление протокола исследования.

Методические указания

1.Культуральные свойства. При осмотре посева в колбочке видна хрупкая морщинистая пленка.

2.Морфологические свойства.

а) Окраска по Граму. Готовят препарат из культуры поверхностной пленки. Под микроскопом видны короткие, расположенные местами це-

почками, грамположительные палочки с центральной неокрашенной спо-

рой. Иногда в препарате обнаруживаются длинные клетки с конечно рас-

положенными спорами по типу барабанных палочек. Это сопутствующая флора.

б) Подвижность. Из культуральной жидкости поверхностной части посева готовят препарат «висячая капля». Микроскопируют при увеличе-

нии 8 и 40; отмечают подвижность клеток и наличие спор в виде блестя-

щих (преломляющих свет) зернышек в центре клетки.

3. Из тонкой поверхностной пленки приготовить фиксированный пре-

парат по Виноградскому (см. пояснения к занятию и следующую задачу),

подсчитать число клеток.

4. Оформить протокол отчета, описав ход исследования и зарисовать культуру.

Картофельная палочка

Признаком накопления картофельной палочки является характерный рост на картофеле, а в жидкой питательной среде – газовыделение и запах,

наличие палочек со спорой, подвижность клеток.

45

Самостоятельная работа

1.Изучение культуральных свойств картофельной палочки.

2.Изучение морфологических свойств.

Методические указания

1. Культуральные свойства. При осмотре ломтиков картофеля обна-

руживается коричневый морщинистый налет (описать подробно характер налета). В пробирках отметить газовыделение, гнилостный запах.

2. Морфологические свойства:

а) Окраска простым способом. Отметить форму бактерий, наличие спор.

б) Подвижность. Из культуральной жидкости готовят препарат «раз-

давленная капля» и микроскопируют объективом 40х. Отмечают подвиж-

ность бактерий. Культуру зарисовывают, сравнивая с морфологическими признаками картофельной палочки.

3. Для подсчета числа клеток в пробирках с мелом и без мела готовят препарат по Виноградскому: стекло обезжиривают, под него помещают полоску миллиметровой бумаги с ограниченной площадью мазка 4–6 мм2.

В центр наносят 0,05 мл суспензии клеток и распределяют по этой площа-

ди. Мазок обрабатывают по методике фиксированного окрашенного пре-

парата.

Подсчет числа клеток по Виноградскому проводят после предвари-

тельного определения площади поля зрения микроскопа при данном уве-

личении. После этого проводят подсчет клеток в поле зрения, причем бе-

рут несколько полей зрения, передвигая препарат по диагонали мазка.

Необходимо насчитать не менее 600 клеток бактерий. Затем полученное число клеток делят на число полей зрения. Количество клеток микроорга-

46

низмов, содержащихся в 1 мл исходной суспензии, вычисляют по формуле

(см. с. 39 части 1).

4. Оформить протокол отчета, отметив ход исследования, культу-

ральные и морфологические свойства картофельной палочки, влияние рН среды на развитие культуры, сравнить количество клеток в пробирке с ме-

лом и без мела.

Протей

Признаками накопления протея являются нежный голубоватый налет культуры на поверхности скошенного агара, форма – короткая грамотри-

цательная палочка, подвижность культуры.

Самостоятельная работа.

1.Изучение культуральных свойств протея.

2.Изучение морфологических свойств протея.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

1.Культуральные свойства. При просмотре посева в верхней части скошенного агара отмечают нежный голубоватый налет.

2.Морфологические свойства

а) Окраска по Граму. Приготовить препарат из культуры верхней ча-

сти налета: под микроскопом видны мелкие грамотрицательные палочки.

Установить наличие или отсутствие у них спор.

б) Подвижность. Из культуры верхних участков налета приготовить препарат «висячая капля» в стерильной водопроводной воде. Микроско-

пировать объективами 8х и 40х. Отметить подвижность клеток.

Сравнить признаки преобладающих в препарате бактерий с призна-

ками, характерными для протея. Отметить наличие и относительное со-

держание других бактерий.

47

3.Зарисовать преобладающие в препарате бесспоровые подвижные мелкие палочки протея.

4.Оформить протокол отчета.

Получение элективной культуры дрожжей

Получение элективной культуры дрожжей основано на их способно-

сти расти в сахаросодержащих субстратах со слабокислой реакцией и на их устойчивости к этиловому спирту.

Самостоятельная работа

1.Выявление накопления дрожжей по наличию в питательной среде осадка и характерных признаков их жизнедеятельности.

2.Определение накопления дрожжей микроскопическим путем.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

1.В пробирке с суслом отметить наличие осадка, указывающего на размножение в среде микроорганизмов.

2.Образование углекислого газа установить по накоплению газа в по-

плавке бродильной пробирки. Кроме того, его можно обнаружить и другим путем: на поверхности забродившего сусла в пробирке (или при встряхи-

вании ее) образуется пена от выделяющегося углекислого газа.

3. Образование спирта обнаруживают по алкогольному запаху забро-

дившего сусла, который усиливается при нагревании.

4.Промикроскопировать осадок, образовавшийся в сусле, приготовив из него препарат «раздавленная капля».

5.Отметить, какие микроорганизмы преобладают в нем, и зарисо-

вать их.

6.Подсчитать количество клеток по Виноградскому.

7.Оформить протокол исследования.

48

Галофилы

Признак накопления галлофилов – помутнение среды, содержащей повышенные концентрации поваренной соли.

Самостоятельная работа

1.Изучение культуральных свойств бактерий.

2.Изучение морфологии культуры во всех трех пробирках.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

1.Культуральные свойства. Пробирки с культурами бактерий в МПБ тщательно встряхнуть, особенно если на дне образовался осадок. Отметить наличие и степень помутнения питательной среды в каждой пробирке, что указывает на интенсивность развития в них микроорганизмов. Степень помутнения выразить условными обозначениями: + малая, + + средняя, + +

+высокая. Сделать заключение, находились ли на сельди солелюбивые микроорганизмы.

2.Морфологические свойства. Приготовить препараты, окрашенные

«простым» способом из развившихся в бульоне микроорганизмов и про-

микроскопировать их.

а) Определить форму клеток, наличие спор у бактерий, преобладаю-

щих в бульоне каждой пробирки. Зарисовать преобладающие в бульоне бактерии.

б) Отметить, обнаружено ли различие (по морфологическим призна-

кам) в составе бактерий, растущих в бульоне с солью и в бульоне без соли.

в) Окраска по Граму. Готовят препарат из помутневшей среды. Под микроскопом отмечают наличие кокковидной и палочковидной микрофло-

ры, окраску.

г) Подвижность. Готовят препарат «висячая капля» из помутневшей среды и микроскопируют при увеличении 8х, а затем 40х.

3. Оформить протокол исследования.

49

Тема VI. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Занятие 14. Методы подавления жизнедеятельности вредных для человека микроорганизмов

Цель занятия: изучение влияния различных факторов окружающей среды на жизнедеятельность и развитие микроорганизмов; ознакомление со способами уничтожения или подавления жизнедеятельности возбудите-

лей микробных заболеваний человека, порчи пищевых продуктов.

Вопросы для обсуждения:

1. Оптимальные, минимальные и максимальные температуры для жизнедеятельности грибов, дрожжей, бактерий. Термофильные, мезофиль-

ные, психрофильные бактерии.

2.Влияние физических факторов на различные микроорганизмы и их споры (высокие и низкие температуры, кислотность среды, осмотическое давление).

3.Влияние химических веществ на микроорганизмы (кислоты, спир-

ты алифатического и ароматического рядов, окислители и др.).

4.Влияние биологических факторов (антибиотики и фитонциды).

5.Методы оценки антимикробного действия факторов внешней сре-

ды, используемые в лабораторной практике.

6. Условные обозначения для выражения интенсивности роста мик-

роорганизмов на питательных средах.

7.Методы определения интенсивности роста микробов при изучении влияния факторов внешней среды на микроорганизмы.

8.Лабораторный способ определения антимикробной активности:

высоких температур, кислотности среды, осмотического давления, анти-

септиков, антибиотиков и фитонцидов.

50