Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

Самостоятельная работа

Работа выполняется на двух занятиях.

Задание на первое занятие:

1. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорга-

низмов чашечным методом.

2.Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для определения микробного числа.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задачи выполняются по выбору группами по 2 человека.

Задача 1. Определение микробного числа почвы

Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и

сусло-агар (для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каж-

дую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях, суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водо-

проводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5–10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку,

заполненную 9 мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:103).

Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и перено-

сят в третью пробирку с 9 мл воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствую-

щего разведения наносят на поверхность питательного агара в чашке Пет-

ри и размазывают стерильным шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при 37 °С 48 ч, а с СА выдерживают при 24 °С 6–7 суток. Подсчет выросших колоний проводится на следую-

щем занятии.

11

Задача 2. Определение микробного числа воздуха

Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седи-

ментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питатель-

ной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в те-

чение определенного времени (5–30 мин), после чего закрывают и термо-

статируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в тече-

ние 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л

воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная коли-

чество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.

Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на водяной бане стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 сте-

рильные чашки Петри (всего 6 чашек). Чашки ставят в месте отбора проб и открывают на 5, 10 и 15 мин. Время выдержки отмечают на крышке чашки.

Затем чашки с МПА термостатируют при 37 °С 48 ч, а с СА – при 24 °С 6–7 суток, перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на следую-

щем занятии.

Задача 3. Определение микробного числа воды

Микробное число воды – это общее количество микроорганизмов, со-

держащееся в 1 мл воды. Для санитарно-микробиологического исследова-

ния водопроводной воды пробы берут из уличных водоразборов и кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают, затем полностью открывают и спускают воду 10 мин, а затем отбирают пробы воды с соблюдением требований асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л. Ес-

ли вода подвергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие

12

2 мл 1,5%-го стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в ага-

ризованную среду 1 мл воды вносят в пустую стерильную чашку Петри,

куда затем наливают 10–12 мл расплавленного МПА (45 °С) и тщательно перемешивают. После застывания агара посевы инкубируют при 37 °С 24 ч. Из одной пробы воды засевают 3 параллельных чашки и не только на МПА, но и на сусло-агар для выявления роста дрожжей и грибов, в этом случае посевы инкубируют 2–3 суток при температуре 24°С.

Задача 4. Определение микробной загрязненности

предметов обихода и рук

Для анализа микробной загрязненности столов, оборудования, поло-

тенец, халатов, рук персонала используют тампонный метод. Для этого го-

товят ватные тампоны, стерилизуют их, погружают в пробирки с 2 мл сте-

рильной воды или изотонического раствора хлорида натрия, при этом там-

пон не должен касаться поверхности жидкости, смачивают тампон непо-

средственно перед взятием проб. Для отбора проб с плоских крупных по-

верхностей (столы) используют трафареты из проволоки или жести, кото-

рые предварительно стерилизуют фламбированием; затем накладывают их на поверхность стола, производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с

поверхности 100 см2, ограниченной трафаретом; тампон помещают в про-

бирку, добавляют еще 8 мл жидкости и тщательно прополаскивают тампон

(салфетку) с последующим отжимом его.

Общую микробную загрязненность определяют, засевая 1 мл смыва в глубину расплавленного МПА в чашке Петри, как это описано для опре-

деления микробного числа воды. Посевы выращивают сутки при 37 °С,

подсчитывают количество выросших колоний и определяют общую мик-

робную загрязненность данного объекта. Для выявления дрожжей и грибов делают посев на сусло-агар.

13

Смывы с рук получают, тщательно протирая ладони, межпальцевые и подногтевые пространства влажным стерильным тампоном на деревянной пилочке. Тампон погружают в ту же пробирку, в которой он смачивался, добавляют еще 8 мл стерильной воды.

Смывы с поверхности предметов содержатся в 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10. Для приготовления разведения 1:100 1 мл исходного смыва (1:10) помещают в пробирку и доливают к нему 9 мл стерильной водопроводной воды. Берут две стерильные чашки Петри, нумеруют их со стороны дна (№ 1 и 2). В первую чашку вносят 1 мл исходного разведения смыва (1:10), во вторую – 1 мл разведения 1:100. Заливают в каждую чашку 15–30 мл расплавленного и охлажденного до 35 °С МПА. После застывания агара посев термостатируют при 37 °С сутки. Параллельно ведут посев на две чашки со стерильным СА. Этот посев выдерживают при 24 °С 4–5 суток.

В отчете по данной работе указать классификацию и способы стерилизации питательных сред, этапы подготовки микробиологических материалов для количественного учета чашечным методом, схему подготовки разведении и посева, описать конкретную задачу.

Занятие 9. Количественный качественный анализ микрофлоры

естественных субстратов. Выделение чистых культур бактерий

Цель занятия – определение степени обсемененности бактериями изучаемого объекта: Определение микробного числа почвы, оценка чистоты воды, воздуха, рук, предметов обихода; изучение культуральных и морфологических свойств микробов, выделенных из исследуемых объектов; ознакомление с понятиями «смешанная» и «чистая» культура, задачами и методами выделения чистых культур.

14

Вопросы для обсуждения:

1.Способы подсчета колоний, выросших в чашках Петри.

2.Признаки колоний, учитываемые при изучении культуральных свойств бактерий.

3.Определение понятий «смешанная» и «чистая» культура.

4.Задачи и методы выделения чистых культур микроорганизмов.

5.Принцип выделения чистых культур по методу Коха.

6.Определение чистоты культуры бактерий.

План работы:

1.Ознакомиться с понятиями «смешанная» и «чистая» культура и мето-

дами выделения чистых культур.

2.Самостоятельная работа.

Содержанием этого занятия является продолжение работы по опре-

делению микробной обсемененности объектов, а именно, подсчет вырос-

ших на твердой питательной среде колоний, изучение культуральных свойств колоний, морфологических свойств бактерий, преобладающих в объекте, и выделение чистой культуры этих бактерий.

Выделение чистой культуры бактерий

Для выявления микроорганизмов, находящихся в изучаемом объекте,

определения их систематического положения (семейство, род, вид) и изу-

чения их свойств необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых чистых культур, а затем идентифицировать – установить идентичность найденных видов микроор-

ганизмов видам, описанным ранее в литературе.

Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного ви-

да, выращенную как потомство одной клетки.

Микроорганизмы чистых культур широко используются в техноло-

гии при производстве антибиотических веществ, аминокислот, ферментов,

15

многих пищевых продуктов (хлеб, вино, пиво, сыры и т. п.). Применение культур микробов с известными свойствами дает возможность эффектив-

нее использовать их деятельность – получать высокий выход и надлежа-

щее качество продукции.

В естественных условиях различные объекты (почва, вода, пищевые продукты) содержат, как правило, смешанную микрофлору. Потому при изучении состава микрофлоры того или иного объекта бактериологическое исследование начинают с выделения микроорганизмов в виде чистых культур.

Существует несколько методов получения чистых культур. Отлича-

ются они между собой приемами выделения из популяции одной-

единственной клетки. Чаще других используют метод, предложенный Ко-

хом, это так называемый чашечный метод или метод истощающего посева на плотной питательной среде.

Самостоятельная работа

1.Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри, и

определение микробного числа.

2.Изучение культуральных свойств колоний, выросших на МПА и СА.

3.Изучение морфологических свойств бактерий и грибов, преобладаю-

щих в исследуемом объекте, путем микроскопирования в препарате «раз-

давленная капля» и фиксированных препаратах.

4. Выделение чистой культуры бактерий, преобладающих в исследуемом объекте.

Методические указания

Задача 1. Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри и определение микробного числа

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 2 суток, колонии

грибов и дрожжей – через 5–7 суток. Колонии, как правило, подсчитывают

16

с помощью лупы, не открывая чашек Петри. Для удобства отмечают про-

считанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. Колонии подсчитывают следую-

щими способами: если они изолированы друг от друга, крупные и в не-

большом количестве, то обычно их считают по всей поверхности чашки;

при большом количестве выросших колоний дно чашки Петри делят на секторы (4–6–8 и т. д.). Подсчитывают в 2–3 секторах, находят, среднее арифметическое на один сектор, а затем умножают на количество секто-

ров. Или подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результа-

ты суммируют; если колонии очень мелкие и их много, то следует пользо-

ваться счетным аппаратом Вольфхюгеля. Аппарат состоит из черной доски и стеклянной пластинки, разделенной на квадраты площадью 1 см2. Чашки необходимо поставить на доску вверх дном, покрыть стеклянной пластин-

кой и подсчитать колонии в квадратах по диагонали (10–12), затем рассчи-

тать среднее арифметическое на один квадрат и пересчитать на площадь всей чашки, используя формулу S = π r2.

Очень удобны для подсчета колоний полуавтоматические счетчики.

Для подсчета колоний чашку Петри помещают на специальный столик,

подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием. Острием пера касаются стекла в участке, где расположена коло-

ния, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держа-

тель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счетчика увеличива-

ются на единицу.

Лучшее разведение то, при высеве из которого на плотной питатель-

ной среде вырастает от 50 до 100 колоний.

Чтобы определить степень обсемененности изучаемого объекта (мик-

робное число), необходимо результат подсчета количества колоний в чаш-

ках Петри помножить на знаменатель соответствующего разведения и вы-

числить среднее арифметическое число из полученных цифр. Среднее

17

арифметическое число высчитывается только из цифр одного порядка.

Например, при анализе посева получили следующее количество колоний в чашках Петри: I – 150, II – 95, III – 7. Полученные цифры умножаем на знаменатель соответствующего разведения:

I 50 х 100 = 15 000

II 95 х 1000 = 95 000

III7 х 10000 = 70 000

Σ180 000 : 3 = 60 000

Следовательно, во взятой навеске исследуемого продукта содержит-

ся 60000 бактерий. По полученным результатам рассчитывают количество бактерий в 1 г или 1 см2 исследуемого продукта. Основные этапы исследо-

вания оформляются в таблицу.

При оценке микробной обсемененности поверхностей рабочих сто-

лов санитарное состояние считается отличным, если общее количество микроорганизмов на 1 см2 от 0 до 100, хорошим – от 100 до 1000, удовле-

творительным – более 1000, плохим – более 10000. Воздух нестерильных помещений считается чистым при микробном числе до 1500, загрязненным

– свыше 2500.

Задача 2. Изучение культуральных свойств колоний микроорганизмов,

выросших в чашках Петри на МПА

Для изучения качественного состава микрофлоры исследуемых объ-

ектов необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых чистых культур, а затем, изучив их свойства (культуральные, морфологические и биохимические), определить систематическое положение (семейство, род, вид) с помощью специальных определителей микроорганизмов.

18

Чистой культурой называется масса клеток, состоящая из микроор-

ганизмов одного вида, или потомство одной клетки.

Каждая изолированная колония, как правило, являясь потомством одной клетки, будет чистой культурой.

Большое значение для идентификации бактерий (семейство, род,

вид) имеют культуральные признаки – это характер роста бактерий на плотных и жидких средах.

Для изучения культуральных свойств бактерий необходимо выбрать на чашках Петри три хорошо обособленные колонии, причем наиболее ти-

пичные, то есть преобладающие в посеве. Затем, не открывая чашек, при-

ступить к описанию внешних свойств колоний, обратив внимание на сле-

дующие признаки (рис. 2–5):

Рис. 2. Формы колонии:

1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю;

4,5 – ризоидные; 6 – амебовидная; 8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная;

11 – концентрическая; 12 – сложная

19

а) форма (круглая, корневидная, неправильной формы, амебовидная,

ризоидная и т. д.);

б) окраска (бесцветная, грязно-белые колонии относятся к бесцветным,

или пигментированная – белая, желтая, золотистая, красная, черная);

в) поверхность колоний (гладкая, шероховатая, бороздчатая, складча-

тая, морщинистая, концентрическиили радиально-исчерченная и т. д.);

г) профиль колонии (плоский, выпуклый, кратерообразный, конусо-

видный и т. д.);

Рис. 3. Профиль колонии:

1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый; 4 – врастающий в субстрат;

5 – плоский; 6 – выпуклый; 7 – каплевидный; 8 – конусовидный

д) блеск и прозрачность (колония блестящая, матовая, тусклая, мучни-

стая, прозрачная);

е) размер колонии (диаметр) измеряют с помощью обычной линейки и указывают ее величину в миллиметрах. Точечными называют колонии ме-

нее 1 мм в диаметре; мелкие имеют 1–2 мм, средние – 2–4 мм и крупные – более 4 мм в диаметре;

ж) край колонии (ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.)

определяют при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы;

чашку помещают на предметный столик микроскопа;

20