Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

Занятие 15. Анализ антимикробного действия факторов

внешней среды

Цель занятия: изучение результатов воздействия на микроорганизмы различных факторов внешней среды (анализ посевов предыдущего заня-

тия).

План занятия. Самостоятельная работа (2-й день исследования).

1.Влияние факторов внешней среды на рост и развитие микробов.

2.Внешний осмотр посева (учет интенсивности задержки роста микро-

бов).

3. Исследование морфологии культуры, выросшей на средах.

Температура

Признаком антибактериального действия высокой температуры в данном опыте является снижение интенсивности или отсутствие роста бак-

терий на плотной среде МПА в зависимости от длительности тепловой об-

работки культуры. О действии температуры на микроскопический гриб су-

дят по величине колонии и степени спороношения.

Самостоятельная работа.

1.Изучение результатов воздействия высокой температуры на бесспоро-

вые и споровые бактерии.

2.Изучение результатов воздействия высокой температуры на развитие мицелиального гриба.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Определение термоустойчивости бесспоровых и споровых бактерий

Для определения термоустойчивости беспоровых и споровых бакте-

рий просматривают секторы чашки, выявляют отсутствие или наличие ро-

61

ста; определяют интенсивность роста ориентировочным визуальным мето-

дом по плотности и по площади слоя, при этом пользуются следующими обозначениями: – (отсутствие роста), + (слабый рост), ++ (умеренный рост), +++ (обильный рост). Для контроля однородности культуры приго-

товляют фиксированные препараты, окрашенные фуксином, из культуры всех секторов (несколько мазков на одном предметном стекле), микроско-

пируют и делают зарисовки.

Результаты опыта записывают в протокол в виде таблицы по следую-

щей форме:

Задача 2. Определение влияния температуры на развитие гриба

Влияние температуры на развитие гриба исследуется по следующим показателям: величина диаметра колоний (измеряется полоской миллимет-

ровой бумаги со стороны дна чашки) и наличие спороношения (величина окрашенной зоны колонии). Результаты опыта описываются по форме:

Кислотность среды

Признаком влияния кислотности среды на размножение бактерий и

дрожжей является снижение интенсивности роста культуры на жидкой

среде.

62

Самостоятельная работа

1.Изучение результатов влияния кислотности среды на культуру дрожжей и гнилостные бактерии.

2.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Рост культуры дрожжей и гнилостных бактерий

Просматривают пробирки с посевами и встряхивают содержимое для равномерного распределения выросшей культуры. Интенсивность роста оценивают по степени мутности среды и обозначают условно (количе-

ством крестов). Для контроля опыта приготовляют фиксированные, окра-

шенные фуксином препараты из содержимого пробирок, в которых отме-

чен рост культуры; микроскопируют и зарисовывают. Результаты опыта записывают по форме:

* Учет интенсивности роста микроорганизмов в жидкой среде: интен-

сивное помутнение среды +++; незначительное ++; еле заметное +; про-

зрачная среда –.

Осмотическое давление

Признак неблагоприятного влияния на жизнедеятельность микробов повышенного осмотического давления среды – снижение интенсивности роста бактерий, которое выражается в уменьшении помутнения среды, а у грибов – в уменьшении грибницы и спороношения.

63

Самостоятельная работа

1.Изучение результата выращивания бактерий на средах с различными концентрациями поваренной соли.

2.Изучение результата воздействия концентрации глюкозы на рост мице-

лиального гриба.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Рост бактерий

Для определения влияния концентрации NaCl на развитие бактерий по интенсивности помутнения среды тщательно перемешивают содержи-

мое пробирок осторожным встряхиванием и вращением пробирки между ладонями. После этого отмечают степень мутности (количеством крестов).

Для исследования однородности культуры из содержимого всех пробирок с помутнением среды приготовляют фиксированные препараты, окраши-

вают фуксином, микроскопируют иммерсионным объективом и зарисовы-

вают в лабораторный журнал.

Задача 2. Рост гриба

Интенсивность роста плесневого гриба устанавливают по развитию грибницы и спорообразованию (окраске грибницы) и выражают ее количе-

ством крестов. Для контроля культуры приготовляют из грибницы препа-

рат типа «раздавленная капля», микроскопируют с объективом 40х и зари-

совывают в лабораторный журнал. Результаты работ записывают в таблице по следующей форме:

Антисептики

Признаком антимикробного действия является замедление интен-

сивности роста микробов при повышении концентрации антисептика.

Об интенсивности роста микробов в данном исследовании судят по степени помутнения среды по сравнению со стерильной средой. Степень мутности выражают количеством крестов.

Самостоятельная работа

1.Изучение результатов выращивания мицелиального гриба в присут-

ствии сорбиновой кислоты.

2.Определение антимикробного действия фенола.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Антибактериальное действие сорбиновой кислоты

Влияние сорбиновой кислоты на мицелиальный гриб определяют по ин-

тенсивности роста культуры. Показателем интенсивности роста служит степень помутнения среды после взбалтывания грибницы. Исследуют так-

же интенсивность окраски грибницы, которая является показателем споро-

образования.

Для контроля чистоты культуры готовят препарат «раздавленная капля» из содержимого пробирки с максимальным ростом (помутнением).

Микроскопируют препарат при средних увеличениях микроскопа.

Задача 2. Антимикробное действие фенола

Просматривают невооруженным глазом пробирки с посевом культу-

ры, отмечают степень помутнения питательной среды в зависимости от концентрации фенола.

65

Для контроля чистоты культуры приготовляют фиксированные пре-

параты из выросших бактерий и окрашивают их фуксином, микроскопи-

руют с иммерсией и зарисовывают в лабораторном журнале по следующей форме:

Антибиотики и фитонциды

Признаком антибактериальной активности антибиотиков и фитонци-

дов является образование зоны роста культуры на МПА вокруг диска, про-

питанного антибиотикам, а также вокруг луночки с измельченным луком:

при наложении дисков на агар антибиотик растворяется влагой среды и диффундирует в окружающую среду; то же происходит с фитонцидами лука. В зависимости от активности антибиотиков и фитонцидов площадь задержки роста различна.

Самостоятельная работа

1.Определение чувствительности бактерий к антибиотикам по величине зоны задержки роста на МПА с дисками.

2.Определение чувствительности мицелиального гриба к фитонцидам лу-

ка по величине зоны задержки роста вокруг луночки с навеской лука.

66

Методические указания

Задача 1. Активность антибиотиков

Рассматривают чашку с посевом бактерий, измеряют с помощью ли-

нейки или миллиметровой бумаги зону задержки роста вокруг каждого диска. Зона диаметром до 15 мм свидетельствует о малой чувствительно-

сти микроба к данному антибиотику, диаметром свыше 25 мм – о высокой чувствительности. Отсутствие зоны задержки роста указывает на устойчи-

вость микроба к данному антибиотику. Результаты записывают по форме:

Задача 2. Активность фитонцидов лука

Рассматривают чашки с посевом мицелиального гриба. Оценивают фитонцидные свойства лука по наличию и величине задержки роста гриба в чашке с луковой кашицей; измеряют диаметр этой зоны с помощью ли-

нейки или миллиметровой бумаги. Отмечают зону отсутствия спороноше-

ния (окраска грибницы) и ее величину. Результаты опыта по форме:

Занятие 16. Количественный учет микроорганизмов

методом непосредственного (прямого) счета

под микроскопом с помощью счетных камер

Цель занятия: освоение метода количественного учета микроорга-

низмов методом прямого счета под микроскопом.

Вопросы для обсуждения:

1.Известные методы прямого счета микроорганизмов.

2.Преимущества и недостатки методов прямого счета микроорганизмов.

3.Устройство счетной камеры и учет микроорганизмов с ее помощью.

4.Оценка качества (свежести) хлебных прессованных дрожжей с помо-

щью микроскопических методов исследования.

План занятия

1.Ознакомиться с сущностью прямых микроскопических методов счета микроорганизмов (данное методическое пособие).

2.Ознакомиться с устройством счетных камер.

Самостоятельная работа

1.Приготовить дрожжевую суспензию из прессованных дрожжей и по-

считать в ней количество дрожжевых клеток, используя камеру Горяе-

ва.

2.Установить количество дрожжевых клеток в 1 г исследуемых пекар-

ских дрожжей.

3.Установить содержание в процентах мертвых клеток в прессованных дрожжах (оценить качество дрожжей).

Пояснение к занятию

Существует несколько методов непосредственного микроскопиче-

ского счета микроорганизмов. Подсчет проводится либо в специальных счетных камерах, либо в микроскопических препаратах.

68

Внимание! Ошибкой методов подсчета микробов под микроскопом является учет не только живых, но и мертвых клеток. Ограничение мето-

дов – необходимость высоких концентраций клеток в единице исследуемо-

го субстрата.

Счетные камеры применяются для счета микроорганизмов относи-

тельно крупных размеров – дрожжей, спор грибов и крупных бактерий, ко-

торые можно обнаружить при микроскопировании оптическими система-

ми со сравнительно малым увеличением. Счетные камеры бывают разных конструкций (Тома, Горяева, Бюркера и др.), но принцип их устройства один и тот же. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки (рис. 7, а).

а

б

h

в

A B

D C

Рис.7 . Счетная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку; h – высота камеры;

в – вид сетки при малом увеличении микроскопа

69

Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, при-

чем на каждой половине нанесена квадратная сетка для подсчета микроор-

ганизмов. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней

(рис. 7, б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Та-

ким образом, если прикрыть стеклянную пластинку с сеткой покровным стеклом так, чтобы оно легло на боковые пластинки, то пространство меж-

ду покровным стеклом и пластинкой с сеткой будет представлять собой камеру глубиной 0,1 мм, дном которой является сетка. Сетка разделена на большие и маленькие квадраты (рис. 7, в): площадь большого квадрата равна 1/25 мм2, малого – 1/400 мм2. А так как слой жидкости над сеткой имеет высоту 0.1 мм, то объем жидкости над большим квадратом будет равен 1/250 мм3, а над малым – 1/4000 мм3.

Для подсчета микробных клеток углубление с сеткой закрывают шлифованным покровным стеклом, тщательно притирают его, а затем пи-

петкой вносят через бороздку камеры исследуемую суспензию. Только при таком порядке работы объем взвеси микробов, находящихся в камере, со-

ответствует расчетному. Число клеток подсчитывают с объективом 8х в де-

сяти больших и двадцати малых квадратах и определяют среднее число клеток в одном квадрате. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии высчитывается по формуле:

M = a103n , hS

где M – число клеток в 1 мл суспензии;

a – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры, мм;

S – площадь квадрата сетки, мм2;

103 – коэффициент перевода мм3 в см3 (мл);

n – разведение суспензии (если оно применялось).

70