Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

Рис. 4. Край колонии:

1 – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный;

6 – реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый

з) структура колонии (однородная, мелкозернистая, крупнозернистая,

струйчатая и т. д.) определяется при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы;

Рис. 5. Структура колонии:

1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая; 4 – струйчатая;

5 – волокнистая

и) консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности бактериологической петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар; слизистой (прилипает к петле),

тягучей, хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

Колонии, отличающиеся хотя бы по одному из указанных признаков,

следует рассматривать как разные типы. Каждому виду бактерий свой-

ственен определенный характер колоний, по числу типов колоний в чаш-

ках можно иметь представление о разнообразии видового состава бактерий исследуемого объекта.

Описанные колонии (2–3) следует зарисовать в тетрадь.

21

Задача 3. Установление чистоты и морфологических свойств бактерий, преобладающих в исследуемом объекте.

Микроскопия бактерий, окрашенных простым способом

Морфологическая характеристика бактерий включает форму клеток,

их сочетание и размер, подвижность, спорообразование. Изучение морфо-

логических свойств проводят, используя методы микроскопии. Для этого готовят препараты живых и фиксированных окрашенных клеток.

Фиксированный окрашенный препарат готовят по способу «простой окраски». На готовый окрашенный препарат наносят каплю иммерсионно-

го масла и микроскопируют объективом с увеличением в 90 раз.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается совершенно светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизмов. При микроскопировании окрашенных препаратов споры бактерий не прокрашиваются. Бактерии следует зарисо-

вать. Убедиться в чистоте культуры. О чистоте культуры судят по одно-

родности клеток. При микроскопировании различных участков препарата необходимо сравнить клетки бактерий. Сходство формы и размера клеток и спор (при их наличии) служит доказательством чистоты культуры.

Задача 4. Выделение чистой культуры бактерий,

преобладающих в исследуемом объекте

Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов яв-

ляется метод, предложенный Кохом. Принцип метода заключаются в по-

лучении чистой культуры из отдельной колонии, которую считают резуль-

татом развития одной клетки.

Чтобы выделить чистую культуру из исследуемого объекта, необхо-

димо из описанных нами колоний выбрать одну, растущую наиболее изо-

лированно и преобладающую в посеве. Затем с помощью стерильной бак-

териологической петли взять небольшое количество бактериальной массы

22

из выбранной колонии, слегка к ней прикасаясь. Необходимо внимательно следить, чтобы не задеть иглой близлежащие колонии. Петлю с бактерия-

ми ввести в пробирку с «косым» мясопептоновым агаром, коснуться по-

верхности в его нижней части и повести петлю вверх, скользя по поверх-

ности агара (не взрыхляя его) в виде штриха. При отвивке необходимо со-

блюдать правила асептики. На пробирку наклеить этикетку с указанием фамилии студента и поставить пробирку в термостат.

Тема IV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ

Занятие 10. Определение чистоты бактерий неизвестного вида.

Посев на дифференциально-диагностические среды

Цель занятия – продолжение исследования по выделению и изуче-

нию чистой культуры бактерий; ознакомление с физиологическими свой-

ствами чистой культуры путем культивирования ее на дифференциально-

диагностических питательных средах.

Вопросы для обсуждения:

1.Этапы выделения и изучения чистых культур бактерий.

2.Необходимость вторичной проверки чистоты выделенной культуры бактерий.

3.Признаки, используемые при определении видового названия бактерий.

4.Чем обусловлено различие физиологических свойств микроорганизмов?

5.Дифференциально-диагностические среды, используемые для изучения протеолитических и сахаролитических свойств бактерий. Способы по-

сева.

6.Почему бактерии, сбраживающие глюкозу, не могут сбраживать саха-

розу или лактозу?

7.Как устанавливается тип дыхания бактерий?

23

8.Чем обусловлена способность бактерий осахаривать крахмал?

9.Как устанавливается у бактерий способность восстанавливать нитраты?

10.Изменения, наблюдаемые в молоке при развитии бактерий, и их объяс-

нение.

11. Принцип идентификации чистой культуры бактерий.

План занятия:

1.Ознакомиться с методикой изучения чистоты неизвестной культуры,

выросшей изолировано на скошенном МПА.

2.Ознакомиться с методикой изучения ферментативных (физиологиче-

ских) свойств бактерий.

3.Самостоятельная работа.

Пояснения к занятию

Содержанием этого и следующего занятий является продолжение этапов выделения и изучения чистой культуры бактерий. На данном заня-

тии изучают чистоту неизвестной культуры, выросшей изолированно на скошенном МПА: внешний вид посева, его однородность и морфологию клеток в микроскопических препаратах. Если культура состоит из бакте-

рий, однородных по культуральным и морфологическим свойствам, произ-

водят посев данного вида бактерий на дифференциально-диагностические среды для изучения физиологических свойств. На этом этапе заканчивает-

ся выделение чистой культуры бактерий неизвестного вида. Дальнейшее исследование выполняется на следующем занятии с целью идентифика-

ции, т.е. определения названия бактерий. При этом рост культуры на диф-

ференциально-диагностических средах позволяет изучить физиологиче-

ские (ферментативные) свойства. По результатам исследования морфоло-

гических, культуральных и физиологических свойств чистой культуры идентифицируют неизвестный вид бактерий, пользуясь альбомами-

определителями.

24

Самостоятельная работа

1.Изучение чистоты культуры бактерий неизвестного вида на скошенном МПА по культуральным свойствам, морфологии в препарате, окрашен-

ном по Граму, и подвижности.

2.Проведение посева чистой культуры бактерий на дифференциально-

диагностические питательные среды.

3.Оформление протокола исследований.

Методические указания

1. Определение чистоты выделенной культуры

Проверка чистоты культуры выделенных бактерий производится в связи с тем, что при отвивке бактерий из колонии могло произойти инфи-

цирование культуры микробами извне.

Чистота выделенной культуры одновременно определяется визуаль-

но и микроскопически. Визуальный контроль – описание культуральных свойств – характера роста бактерий на косом МПА. При этом необходимо отметить массивность бактериального налета (обильный, слабый, умерен-

ный); характер поверхности и окраску, а главное, – однородность роста бактериальной культуры по всему штриху. Если штрих неоднороден, куль-

тура считается загрязненной (такую культуру изучать нельзя).

Морфологические свойства: форму клетки бактерий и тинкториаль-

ные свойства изучают в мазке, окрашенном по Граму. С этой целью отби-

рают бактериологической петлей часть культуры и окрашивают фиксиро-

ванный мазок по Граму. При микроскопии отмечают тинкториальные свойства бактерий (гр+ или гр–). Однородность культуры в десяти про-

смотренных полях зрения свидетельствует о чистоте выделенных бакте-

рий. Подвижность культуры устанавливается при микроскопировании бак-

терий в живом состоянии в препаратах «висячая капля» или «раздавленная капля» объективом 40х при слабом освещении. Необходимо отличать соб-

25

ственную активную подвижность клеток (движение в разных направлени-

ях) от движения с током жидкости (движение клеток в одном направлении)

и от броуновского движения молекул воды (бактерии движутся беспоря-

дочно около одних и тех же точек поля зрения). Бактерии следует зарисо-

вать и определить их принадлежность к семейству и роду (по морфологи-

ческим признакам).

2. Посев бактерий на дифференциально-диагностические среды

Для определения видовой принадлежности бактерий необходимо изучить физиологические (ферментативные) и культуральные признаки. С

этой целью делают посевы исследуемой чистой культуры на специальные дифференциально-диагностические среды.

Наиболее важными физиологическими признаками бактерий явля-

ются следующие:

Отношение к кислороду (тип дыхания) определяется путем посева бактерий в МПА, который находится в пробирке в виде высокого столби-

ка. Для посева взять кончиком стерильной бактериологической иглы не-

много бактериальной массы и внести в столбик МПА путем его прокола по центру на всю длину иглы. Далее иглу вынуть строго по линии прокола.

Способность разжижать желатин (разлагать белковые вещества)

устанавливается при выращивании бактерий в столбике мясо-пептонного желатина (МПЖ). Посев делается аналогично посеву в столбик МПА.

Способность осахаривать крахмал выявляется при выращивании на МПА, смешанном с крахмальным клейстером (в чашке Петри).

Способность восстанавливать нитраты определяется при выращи-

вании микроорганизмов в МПБ с 1%-ным KNO3.

Среда заготавливается в пробирке; в нее опускается газоуловитель-

поплавок. Из чистой культуры кончиком бактериологической иглы взять бактерии и занести в среду путем погружения в нее иглы.

26

Способность сбраживать сахара (глюкозу, сахарозу, лактозу) уста-

навливается путем выращивания бактерий в МПБ с добавлением соответ-

ствующего сахара и индикатора Андреде. Среда заготавливается в пробир-

ках с поплавками. Посев в среду производится так же, как и в МПБ с

KNO3.

Действие на молоко определяется путем выращивания микроорга-

низмов в стерильном обезжиренном молоке. Посев делается таким же об-

разом, как в предыдущем опыте. Необходимо выявить дополнительно сле-

дующие культуральные свойства.

Характер роста в МПБ (пленка и ее вид, осадок, помутнение) опре-

деляется при выращивании чистой культуры в МПБ с KNO3 или с сахаром.

Характер роста на картофеле выявляется при выращивании микро-

организмов на скошенном кусочке стерильного картофеля.

Все посевы производят асептически возле пламени спиртовки, чтобы в них не попали посторонние микроорганизмы. Пробирки с посевами (за исключением МПЖ) собрать в стакан, в который вложить этикетку с ука-

занием фамилии студента. На пробирку с МПЖ и чашку Петри с МПА и крахмалом наклеить такую же этикетку.

Стакан с пробирками и чашку поставить в термостат с температурой

25 °С. Пробирку с МПЖ оставить при комнатной температуре, т. к. жела-

тин при 25 °С разжижается.

В протокол исследования записать, в какие питательные среды и как произведены посевы, с какой целью.

Занятие 11. Идентификация бактерий

(продолжение занятия 10)

План занятия:

1.Произвести анализ результатов опытов по выявлению ферментатив-

ных и культуральных признаков бактерий.

27

2.Ознакомиться с определением вида бактерий по определителю бакте-

рий Берджи.

Методические указания

Анализ исследования ферментативных свойств бактерий

Пробирки с посевами культуры в жидких питательных средах от предыдущего занятия осторожно, не взбалтывая, расставить в штатив, рас-

смотреть и описать физиологические и культуральные признаки изучае-

мых бактерий.

Отношение к кислороду установить по месту роста бактерий в стол-

бике МПА. Если рост биомассы поверхностный, то бактерии являются строгими аэробами. Если рост обнаруживается равномерно по всему стол-

бику МПА, то бактерии имеют факультативно анаэробный тип дыхания.

Анаэробные бактерии развиваются на дне пробирки.

Способность разжижать желатин характерна лишь для бактерий,

имеющих протеолитические ферменты, в частности желатиназу. При этом различные виды бактерий образуют определенную форму разжижения МПЖ: в виде воронки – воронковидное разжижение; в виде мешка – меш-

ковидное; в виде ровного слоя – послойное. Бактерии, не имеющие жела-

тиназы, не вызывают изменения желатина.

Способность осахаривать крахмал (амилолитическое или диастати-

ческое действие) проявляют бактерии, содержащие фермент амилазу (диа-

стаз). Амилаза вызывает гидролиз крахмала. Для выявления этой способ-

ности необходимо нанести в чашки на поверхность МПА около бактери-

альной массы несколько капель реактива Люголя (раствор йода в йодистом калии). Если крахмал гидролизовался, посинения среды не произойдет. Ес-

ли же среда окрасится в синий цвет, то это укажет на отсутствие фермента амилазы у исследуемых бактерий.

Способность восстанавливать нитраты выявляется по накоплению газа в поплавке и нитритов (МПБ + KNO3). Нитриты устанавливают каче-

28

ственной химической реакцией, добавляя в пробирку 1–2 капли раствора йодистого калия (KJ), серной кислоты (H2SO4) и крахмала. В присутствии нитритов среда синеет. Нитриты обычно в кислой среде вытесняют йод из его соединений, он и реагирует с крахмалом.

Способность сбраживать сахара выявляют после описания характера роста бактерий в МПБ с сахарами. При этом следует отметить наличие пленки и ее характер (плотный, рыхлый, зернистый и т. д.) и помутнение среды (слабое, сильное, умеренное). Способность сбраживать сахара обна-

руживается по подкислению питательной среды и газообразованию. Неко-

торые бактерии, используя сахара, образуют и газ, и кислоты, а другие – только органические кислоты. Газообразование устанавливается по накоп-

лению газа в поплавке, а кислотообразование – по изменению цвета пита-

тельной среды (покраснение) под действием заранее введенного в среду индикатора Андреде.

Бактерии оказывают различное влияние на молоко:

свёртывание молока наступает в том случае, если в питательной среде произошло накопление органических кислот за счет сбраживания лакто-

зы. При этом образуется плотный сгусток молока (простокваша);

коагуляция молока (сычужное свертывание) происходит без изменения реакции среды, сгусток получается неплотный;

пептонизация молока наступает при гидролизе белков, образуется мут-

ная или желтоватая жидкость горького вкуса, кислотность может пони-

жаться.

Рост на картофеле бактерии проявляют по-разному. В данном случае

наблюдают массивность бактериального налета, его окраску и характер поверхности. Наблюдения внести в таблицы Карта свойств бактерий, вы-

деленных в чистой культуре, составляется по следующим формам в виде таблиц:

29

Морфологические свойства

После изучения культуральных, морфологических и физиологиче-

ских свойств бактерий (см. занятия 9–11) можно определить их вид, ис-

пользуя «Определитель бактерий и актиномицетов» Н.А. Красильникова или «Определитель микробов» Д. Берджи.

Тема V. БИОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ. ЭЛЕКТИВНЫЕ (НАКОПИТЕЛЬНЫЕ)

КУЛЬТУРЫ

Занятие 12. Изучение методов получения накопительных культур для выделения микроорганизмов разных физиологических групп

Цель занятия: ознакомление с понятием элективная (накопительная)

культура и способом ее получения; освоение методов получения электив-

ных культур исходя из знания физиологических особенностей микроорга-

низмов.

Вопросы для обсуждения:

1.Понятия «элективная культура», «элективная среда».

2.Практическое значение метода элективного культивирования микроор-

ганизмов.

30